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Frequency distribution of telomere maintenance mechanisms in soft tissue sarcoma

Sander, Petra :
Frequency distribution of telomere maintenance mechanisms in soft tissue sarcoma.
TU Darmstadt / Biologie
[Ph.D. Thesis], (2010)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Frequency distribution of telomere maintenance mechanisms in soft tissue sarcoma
Language: English
Abstract:

Molecular mechanisms, which cause changes of the ends of chromosomes, the telomeres, play an important role in the generation of genomic instability. In normal somatic cells, the length of the telomeres are shortened during cell division due to the inability of the cells to replicate their chromosome ends completely. Telomeres below a critical length are dysfunctional and undergo apoptosis or permanent growth arrest referred to as replicative senescence. One possibility to bypass telomere dysfunction and maintenance of stable telomere length is the activation of a telomere maintenance mechanism. The currently known telomere maintenance mechanisms in humans are telomerase activity (TA-activity) and the alternative lengthening of telomeres (ALT-Mechanism). The preliminary goal of the thesis was to assess the frequency distribution of the activation of telomerase and of the ALT-mechanism in the major soft tissue sarcomas subtypes, which had been genetically well characterized in preceding studies. A first step of the thesis was the establishment of a method to assess the ALT-mechanism. One hallmark of ALT positive tumors/cells is the presence of ALT-associated promyelocytic leukemia (PML) bodies (APBs). APBs are characterized by promyelocytic leukemia (PML) bodies, which colocalize with telomeric DNA or telomere-specic binding proteins. A further marker of ALT is their highly heterogeneous telomere length with some exceptionally long telomeres. In order to assess ALT in human soft tissue sarcoma subtypes by combined telomere uorescence in situ hybridization and PML immunouorescence, confocal laser scanning microscope was used. 3D images were acquired, which visualize telomere spots in the rst channel, PML bodies in the second channel and DAPI stained nuclei in the third channel. The central task of image analysis was to automatically detect and classify APBs within the cell nucleus as well as to detect and quantify very large telomeres. Telomerase activity was evaluated by the TRAP assay (telomeric repeat amplication protocol). Afterwards, these data were correlated with the number of chromosomal imbalances detected by comparative genomic hybridization (CGH). This study contributed to the understanding of the frequency distribution of telomere maintenance mechanisms in soft tissue sarcoma subgroups and whether these mechanisms are associated with specic chromosomal imbalances. The most important results based on this thesis are: 1. The study demonstrates that the occurrence of the telomere maintenance mechanism is characteristic for the subtype of soft tissue sarcoma. The presence of telomerase activity ranges from 100% in synovial sarcoma to 46% in pleomorphic liposarcomas. The frequency of the marker for the ALT mechanism depends on the subtype of soft tissue sarcoma. While the telomeres detected in synovial sarcomas were equal in length, 92% of all cases of pleomorphic liposarcomas showed exceptionally long telomere signals. Furthermore, the correlation of both telomere maintenance mechanisms has shown that in tumors with high telomerase activity, the markers for the ALT-mechanism are significantly reduced. 2. In order to investigated an abundant number of healthy tissue with regard to markers for the ALT mechanism automatic quantication were performed. Healthy tissue, as well as our investigated tumor samples, show the appearance of ALT-associated PML bodies, whereas no telomeres with heterogeneous size and exceptionally long telomeres could be detected in healthy tissue. Therefore an important questions remains: how tightly are APBs linked to the ALT mechanism? 3. Comparative genomic hybridization (CGH) allows for a genome-wide screen for chromosomal imbalances in tumor samples. The correlation of the CGH data and the telomere maintenance mechanisms revealed that tumors with telomerase activity show a dierent cytogenetic prole compared to those tumors with markers for ALT. In respect to the frequency of chromosomal imbalances, such as gains and losses, there were no dierences between both telomere maintenance mechanisms. 4. A new approach for an automated quantication of telomere and PML spots as well as colocalization in multi-channel 3D microscopy images to assess the ALT mechanism were developed. To discriminate between spots inside and outside the cell nucleus, DAPI staining was used for the nuclear segmentation. With our program more than 500 confocal images were successfully analyzed. The characterization of tumors is highly relevant for tumor diagnostics and treatment planning. Due to the appearances of APBs in healthy tissue, one important question remains. How tightly are these structures linked to the ALT-mechanism? Further investigation is needed to clarify if in healthy tissue APBs are induced by the ALT mechanism or other nuclear processes besides ALT. Therefore, the characterization and understanding of telomere maintenance mechanism in tumorigenesis could have important implications in the development new treatments for these malignancies.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Molekulare Mechanismen, die zu Veränderungen von Chromosomen-Telomeren führen, spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung chromosomaler Instabilität. Telomere verkürzen sich mit jeder Zellteilung, was beim Erreichen einer kritischen Länge zu replikativer Seneszenz oder Apoptose der Zelle führt. In Tumorzellen wird diese gegen unbegrenztes Wachstum gerichtete Kontrolle durch Telomer-erhaltende Mechanismen(engl.: Telomere Maintenance Mechanismen = TM-Mechanismen) aufgehoben. Zu den bekannten TM-Mechanismen zählen die Telomerase-Aktivierung (TA) und der alternative Längenerhalt von Telomeren (ALT = Alternative lengthening of telomeres). Primäres Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Häufigkeitsverteilung des TA- und des ALT-Mechanismus in einem umfassenden Kollektiv an Weichteilsarkomen welches in vorangegangenen Projekten, pathologisch, molekular-genetisch und klinisch eingehend unter anderem hinsichtlich ihrer chromosomalen Veränderungen untersucht wurde. Ein Schwerpunkt der hier beschriebenen Arbeit lag zunächst in der Etablierung der Methoden zur Detektion des ALT-Mechanismus. Die hierzu am häugsten verwendeten Marker sind zum einen Kolokalisationen zwischen Telomeren und PML-Kernkörperchen (PML: Promyelozytische Leukämie), auch ALT-assoziierte PML-Kernkörperchen (APBs) genannt, und zum anderen die Heterogenität in der Größe der Telomere mit dem zusätzlichen Auftreten von extrem großen Telomeren-Signalen. Hierzu wurde zunächst ein Protokoll für eine kombinierte Telomere Fluoreszenz in situ Hybridisierung (Detektion: Telomere) mit anschließender Immunuoreszenz (Detektion: PML-Kernkörperchen) etabliert. Für die in diesem Zusammenhang erstellten konfokalen Aufnahmen wurde ein Programm zur automatischen Auswertung der Marker des ALT-Mechanism entwickelt. Für die Bestimmung der Telomerase-Aktivität wurde das TRAP-Verfahren (Telomeric Repeat Amplification Protocol) verwendet. Diese Daten wurden anschlieÿend vergleichend mit den Daten der chromosomalen Veränderungen in Bezug gesetzt. Die Studie sollte die Häugkeitsverteilung von TM-Mechanismen in Weichteilsarkomen ermitteln und klären, ob diese mit spezifischen chromosomalen Imbalancen assoziiert sind. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit lauten: 1. Das Auftreten der Telomer-erhaltenden Mechanismen ist stark von den einzelnen Weichteilsarkom-Subtypen abhängig. Telomerase-Aktivität variiert von 100% in synovialen Sarkomen bis hin zu 46% in pleomorphen Liposarkomen. Das Auftreten der Marker die den ALT-Mechanismus charakterisieren, sind ebenso mit den verschiedenen Weichteilsarkom-Subtypen assoziiert. Während in synovialen Sarkomen keine sehr groÿe Telomere-Signale detektiert werden konnten, liegt dieser Anteil bei pleomorphen Liposarkomen bei 92%. Die Korrelation beider Telomer-erhaltenden Mechanismen hat ergeben, dass die Anzahl der Kolokalisationen zwischen Telomeren und PML-Kernkörperchen als auch die der sehr groÿen Telomer-Spots mit der Höhe Telomerase-Aktivität assoziiert ist. 2. Neben Tumorgewebe wurde in dieser Arbeit auch ein umfangreiches Kollektiv von gesundem Gewebe auf Indikatoren des ALT Mechanismus untersucht. Die Ergebnisse der automatischen Analyse zeigen im gesunden Gewebe ebenso wie im Tumorgewebe das Auftreten von Kolokalisationen zwischen Telomeren und PML-Kernkörperchen. Im Vergleich zu Tumorgewebe konnten jedoch in gesundem Gewebe keine übergroßen Telomer-Spots detektiert werden. Diese Analyse stellt APBs als quantitativen Marker für den ALT-Mechanismus in Frage. Das Auftreten von sehr großen Telomere-Signalen wurde nur in Tumorgewebe gefunden wurde. 3. Die vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) stellt einen Ansatz dar, mit welchem ein robuster Nachweis von chromosomalen Imbalancen aufgezeigt werden kann. Die Korrelation der CGH-Daten mit den Telomere-erhaltenden Mechanismen gibt keinen Hinweis darauf, dass bei einem der Mechanismen präferenziell mehr chromosomale Imbalancen auftreten. Die Analyse hat jedoch ergeben, dass Weichteilsarkome mit Telomerase-Aktivität ein dierenziertes zytogenetisches Profil gegenüber solchen Weichteilsarkomen mit Marker für den ALT-Mechanismus aufweisen. 4. Im Rahmen diese Arbeit wurde für die automatische Quantifizierung von Kolokalisationen aus konfokalen mikroskopischen Aufnahmen ein Computerprogramm entwickelt. Mittels dieses Programms können Indikatoren für den ALT Mechanismus wie ALT-assoziierte PML-Kernkörperchen und überdurchschnittlich große Telomere detektiert werden. Die Detektion der verschiedenen Marker innerhalb des Zellkerns, wird über die Kernsegmentierung ermittelt. Mit Hilfe der vollautomatischen Auswertung war es möglich über 500 konfokale mikroskopische Bilderstapel zu analysieren und auszuwerten. Die Charakterisierung von Tumoren spielt in der klinischen Diagnostik und in der Beurteilung von Therapie-Entscheidungen eine wichtige Rolle. Mit dem Auftreten der ALT-assoziierten PML-Kernkörperchen in gesundem Gewebe, muss in weiteren Studien geklärt werden, wie stark diese spezielle Kernstruktur direkt mit dem ALT-Mechanismus assoziiert ist. Die Charakterisierung von Telomere-erhaltenden Mechanismen und ihre Rolle in der Tumorgenese könnten die Basis für neue gezielte therapeutische Ansätze bilden.German
Uncontrolled Keywords: Telomere, Telomere-erhaltenden Mechanismen, Weichteilsarkome
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Telomere, Telomere-erhaltenden Mechanismen, WeichteilsarkomeGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Botany > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 03 Feb 2010 06:50
Last Modified: 07 Dec 2012 11:56
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-20381
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Rieker, PD Dr. Joachim Ralf and Engstler, Prof. Dr. Markus
Refereed: 26 January 2010
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2038
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