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Rolle der N-terminalen Domänen (NTDs) bei der Assemblierung und Funktion von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren

Mesic, Ivana :
Rolle der N-terminalen Domänen (NTDs) bei der Assemblierung und Funktion von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2010)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Rolle der N-terminalen Domänen (NTDs) bei der Assemblierung und Funktion von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren
Language: German
Abstract:

N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) gehören zusammen mit den non-NMDA-Rezeptoren (AMPA- und Kainat-Rezeptoren) zu der Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs). NMDARs sind wichtig für die Weiterleitung von exzitatorischen Signalen zwischen Neuronen, Prozesse wie Lernen und Gedächtnisbildung sowie die Pathophysiologie von neurologischen Erkrankungen. Das gemeinsame Merkmal der iGluRs ist ihr modularer Aufbau, wobei die jeweiligen Domänen eine vergleichbare Struktur sowie Funktion zu besitzen scheinen. Für die extrazellulär angeordneten N-terminalen Domänen (NTDs) wird angenommen, dass sie bei allen iGluRs die Determinanten der Assemblierung sind und bei den NMDARs zusätzlich die Modulation der Rezeptorfunktion bedingen. Der tetramere NMDAR ist aus homologen NR1-, NR2A-D- und NR3A-B-Untereinheiten aufgebaut. Der sogenannte ´konventionelle´ NMDAR setzt sich aus den Glyzin-bindenden NR1- und Glutamat-bindenden NR2-Untereinheiten zusammen. Die Ligandenbindungsdomänen (LBDs) dieser Untereinheiten bilden zweiblättrige Strukturen aus, welche in einer ´Rücken-an-Rücken´-Konformation angeordnet sind. Dadurch entstehen intermolekulare Wechselwirkungen im NR1/NR2-Hetero-Dimer, deren Stabilität das Ausmaß der NMDAR-Aktivierung und der Desensitisierung bestimmt. Aufgrunddessen wird das Hetero-Dimer als die funktionelle Einheit im Rezeptor angesehen. Beim NR1/NR3-Rezeptor, welcher durch Gylzin allein aktivierbar ist, bewirkt die Ligandierung der NR3-LBD die Aktivierung des Rezeptors. Die anschließende Ligandierung der NR1-LBD führt dagegen zur Inaktivierung, d.h. zur Auto-Inhibition des NR1/NR3-Rezeptors, deren Determinanten noch unbekannt sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Rolle der NTDs bei der Assemblierung, Stöchiometrie und Funktion von NMDARs zu untersuchen. Für die biochemische Analyse dieser Fragestellung wurden die NMDARs rekombinant in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und mit [35S]-Methionin bzw. Cy5 markiert. Anschließend folgte die affinitätschromatographische Aufreinigung über die Hexahistidyl-Markierung von einer der exprimierten Untereinheiten sowie die Analyse anhand der blau-nativen- und der SDS-Polyacrylamid-Gelelektophorese. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei NMDARs die NTD-Deletion keine Auswirkung auf die Assemblierung, die Stöchiometrie oder die Zelloberflächen-Expression hatte. Zusammenfassend sind, im Unterschied zu den non-NMDARs, bei NMDARs die NTDs nicht für die Ausbildung funktioneller Rezeptoren notwendig. Die funktionelle Analyse der Glyzin-vermittelten Rezeptorströme von Wildtyp- und NTD-deletierten NR1/NR3A- und NR1/NR3B-Rezeptoren anhand der Zwei-Elektroden Spannungsklemme zeigte, dass die NTD-Deletion zur Aufhebung der NR1-LBD-vermittelten Auto-Inhibition führt. Somit bestimmen die NTDs das Ausmaß der Rezeptoreffizienz. Dieser Befund korreliert mit der Verringerung der Rezeptordesensitisierung bei NR1/NR3A-Rezeptoren. Für das Auftreten beider Effekte war schon die selektive NR3-NTD-Deletion ausreichend. NR1/NR3A/NR3B-Rezeptoren zeichnen sich durch große Glyzin-induzierte Rezeptorströme auf, die nicht auto-inhibiert werden. Im Einklang damit, hatte die NTD-Deletion keine Auswirkung auf die Rezeptoreffizienz. Die Aufhebung der Auto-Inhibition bei NR1/NR3A/NR3B-Rezeptoren und das Vorhandensein dieser bei NR1/NR3A- bzw. NR1/NR3B-Rezeptoren können auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen den funktionellen Einheiten zurückgeführt werden. Anders als bei NR1/NR3A- und NR1/NR3B-Rezeptoren, agiert bei NR1/NR3A/NR3B-Rezeptoren Zn2+ als ein hoch-affiner allosterischer Inhibitor von Glyzin-induzierten Strömen. Die Mutation der NR1-Glyzinbindetasche bedingt zwar ein geringeres Ausmaß der Zn2+-Inhibition, jedoch nicht deren Aufhebung. Somit besitzt Zn2+ mindestens eine weitere Bindestelle im NR1/NR3A/NR3B-Rezeptor. Die hier erhaltenen Daten zeigen auf, dass es andere Determinanten für die NMDAR-Assemblierung als die NTDs geben muss und diese sich somit in den verbleibenden NMDAR-Domänen befinden. Die Erkenntnisse über die NTD-bedingte Modulation der NR1/NR3-NMDA-Rezeptorfunktion können bei zukünftigen Studien als ein Mittel dienen, diese Rezeptoren in vivo, z.B. durch den Einsatz von spezifischen Proteasen, zu detektieren. Das Wissen der Eigenschaften von funktionellen Einheiten kann für die Aufklärung der vermeintlich konträr agierenden Hetero-Dimere in NR1/NR2/NR3-Rezeptoren, die bereits in vivo detektiert wurden, von großer Bedeutung sein.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The family of the ionotropic glutamate receptors (iGluRs) mediates the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system. It is subdivided into three subfamilies: N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) AMPA receptors and kainate receptors, whereas the NMDARs stand out with respect to their key role in processes such as learning and memory as well as the pathophysiology of neurological diseases. The tetrameric NMDAR is composed of homologous NR1, NR2A-D und NR3A-B subunits. A unique feature of conventional NMDA receptors composed of the NR1 and NR2 subunits is that the simultaneous binding of two ligands, glycine and glutamate, respectively, is required for efficient channel opening. In contrast, NMDA receptors composed of NR1 and NR3 subunits form receptors that are activated by glycine alone, though with a very low efficiency. This has been suggested to result from glycine-binding to the NR1 subunit which inhibits the receptor response by decreasing the efficacy of channel opening. Hence, glycine-binding to the NR1 subunit has different effects on NR1/NR2 and NR1/NR3 receptor function: it is required for the activation of conventional NR1/NR2 receptors but mediates an ´auto-inhibition´ of NR1/NR3 receptors. The common feature of all iGluRs is their modular design. Thereby, each of the respective modules/domains seem to posses similar structure and function. The extracelullarly located N-terminal domains, in particular, were supposed to be the main determinants of the assembly of all iGluRs and are additionally responsible for the modulation of NMDAR function. Further, crystallographic studies have revealed that the NR1- and NR2-LBDs form bi-lobate structures which are arranged in a ´back-to-back´ fashion. Thereby, intermolecular interactions in the NR1/NR2 hetero-dimer are generated whose stability accounts for the extent of NMDAR activation and desensitization. Therefore, the hetero-dimer acts as the functional unit in NMDARs. One of the aims of this study was to approach the role of NTDs in the assembly and function of NMDARs, histidin-tagged NR1, NR2 and NR3 subunits were recombinantly expressed in Xenopus laevis oocytes, labeled with either [35S]-Methionin or a cell-membrane impermeable dye Cy5 and analyzed via affinity chromatography and blue native polyacrylamid gelelectrophoresis (BN-PAGE) as well as SDS-PAGE. Here, it is shown that NTD-deletion does not affect a proper subunit assembly, the stoichiometry and membrane-insertion of NR1/NR3 receptors. Thus, in contrast to non-NMDARs, NTDs are not necessary for the formation of functional NMDARs. The functional analysis of the glycine-mediated currents of wt and NTD-deleted NR1/NR3A and NR1/NR3B receptors via two-electrode voltage-clamp revealed that NTD-deletion induced the relief of NR1-LBD-mediated receptor ´auto-inhibition´. Thus, die NTDs are determinants of the receptor efficacy. This finding correlates with a reduced receptor desensitization at NR1/NR3A receptors. The selective NR3-NTD-deletion is sufficient for the occurance of both effects. In contrast to findings at NR1/NR3A and NR1/NR3B receptors, the currents of triheteromeric NR1/NR3A/NR3B receptors are not ´auto-inhibited´. In line with this, the deletion of NTDs had no impact on the receptor efficacy. The relief of ´auto-inhibition´ of NR1/NR3A/NR3B receptors and the occurance of it in NR1/NR3A and NR1/NR3B receptors can be attributed to differences in the interaction of the functional units in the receptor. The findings of NTD-mediated inhibition of NR1/NR3 NMDA receptor function obtained in this study could provide a tool to detect these receptors in vivo, e.g. by using specific NR1- and NR3-NTD-removing proteases. Furthermore, the knowledge about the properties of the functional units of NMDA receptors could help elucidating the interaction of the presumably inversely acting hetero-dimers in NR1/NR2/NR3 receptors, detected in vivo.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Zoology > Systems Neurophysiology
Date Deposited: 29 Jan 2010 13:45
Last Modified: 07 Dec 2012 11:56
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-20326
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Laube, PD. Dr. Bodo and Galuske, Prof. Dr. Ralf
Refereed: 27 November 2009
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2032
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