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Development of a platform for immobilization of proteins based on Bacillus subtilis spores

Karava, Marianna (2021):
Development of a platform for immobilization of proteins based on Bacillus subtilis spores. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00019729,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Development of a platform for immobilization of proteins based on Bacillus subtilis spores
Language: English
Abstract:

The increasing demand for development of sustainable production processes has extended the application repertoire of biotechnology. Microorganisms and enzymes are the protagonists in the race towards sustainability. To this end, surface display of polypeptides on biological carriers has evolved as a rather valuable tool for the cost efficient production of biocatalysts. Among a variety of available bio-carriers, spores from Bacillus subtilis have several advantages such as genetic amenability, robust structure that endures harsh conditions, cost and time efficient methods for production and purification. The most common strategy for spore display is the fusion protein technology. Proteins or peptides of interest are fused to coat proteins thus facilitating immobilization on the spore surface. The main objective of the present dissertation was to utilize spores as bioparticles for immobilization of enzymes. To this end, the current study focused on the improvement of specific properties of the B. subtilis spores and established state of the art methods for their qualitative and quantitative analysis. Conceptually this study is separated in two research projects. Chapter 3 comprises the genetic engineering of B. subtilis as well as the development of a flow cytometric method for quantification and analysis of spores. Within this framework B. subtilis germination deficient strains were developed. In addition a mutant strain with higher sporulation efficiency was constructed. Following, the investigation was focused on the development of a rapid method for quantification of spores. To this end, flow cytometry combined with nucleic acid fluorescence staining were employed. The developed method allowed the resolution of up to three cell populations formed during sporulation including spores, cells and cells containing forespores. Chapter 4 covers the application of recombinant spores in biocatalytic processes. Initially a small size library of components for spore display was designed and tested by utilizing fluorescent proteins. In view of applying spore display for biocatalysis, a recently discovered light inducible fatty acid decarboxylase from Chlorella variabilis (CvFAP) was presented on the spore surface. The displayed enzyme was extensively characterized using palmitic acid as substrate. Aiming at the production of hydrocarbons from natural oils CvFAP displaying spores were combined with lipase in one pot one step bienzymatic cascade. From the bioconversion, hydrocarbon titers up to 64 mg/L were obtained. Finally the applicability of spore display was tested for the production of glycosides from the low cost substrate, sucrose. For this purpose, two different variants of sucrose phosphorylase were displayed, one deriving from Leuconostoc mesenteroides (LmSucP) and the other one deriving from Bifidobacterium adolescentis (BaSucP). Both enzymes were evaluated for their efficiency to perform phosphorolysis of sucrose to alpha-D-glucose-1-phosphat (G1P) and fructose. Only trace amounts of G1P were detected for the reaction catalyzed by LmSucP while BaSucP could convert up to 66 % of the initial substrate.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die steigende Nachfrage nach der Entwicklung nachhaltiger Produktionsprozesse hat das Anwendungsrepertoire der Biotechnologie erweitert. Mikroorganismen und Enzyme sind die Protagonisten im Wettlauf zur Nachhaltigkeit. Zu diesem Zweck hat sich das Oberflächendisplay von Polypeptiden auf biologischen Trägern als ein recht wertvolles Werkzeug für die kosteneffiziente Produktion von Biokatalysatoren entwickelt. Unter einer Vielzahl verfügbarer Bioträger haben Sporen von Bacillus subtilis mehrere Vorteile, wie z. B. genetische Zugänglichkeit, robuste Struktur, die rauen Bedingungen standhält, sowie kosten- und zeiteffiziente Methoden zur Produktion und Reinigung. Die gängigste Strategie für das Sporen-Display ist die Fusionsprotein-Technologie. Interessante Proteine oder Peptide werden mit Hüllproteinen fusioniert, um die Immobilisierung auf der Sporenoberfläche zu erleichtern. Das Hauptziel der vorliegenden Dissertation war es, Sporen als Biopartikel für die Immobilisierung von Enzymen zu nutzen. Zu diesem Zweck konzentrierte sich die aktuelle Studie auf die Verbesserung spezifischer Eigenschaften der B. subtilis-Sporen und etablierte Methoden nach dem Stand der Technik für deren qualitative und quantitative Analyse. Konzeptionell ist diese Studie in zwei Forschungsprojekte aufgeteilt. Kapitel 3 umfasst die gentechnische Veränderung von B. subtilis sowie die Entwicklung einer durchflusszytometrischen Methode zur Quantifizierung und Analyse von Sporen. In diesem Rahmen wurden B. subtilis keimungsdefiziente Stämme entwickelt. Darüber hinaus wurde ein mutierter Stamm mit höherer Sporulationseffizienz konstruiert. Anschließend konzentrierte sich die Untersuchung auf die Entwicklung einer schnellen Methode zur Quantifizierung von Sporen. Zu diesem Zweck wurde die Durchflusszytometrie in Kombination mit Nukleinsäure-Fluoreszenzfärbung eingesetzt. Die entwickelte Methode erlaubte die Auflösung von bis zu drei Zellpopulationen, die während der Sporulation gebildet werden, darunter Sporen, Zellen und Zellen, die Vorsporen enthalten. Kapitel 4 behandelt die Anwendung von rekombinanten Sporen in biokatalytischen Prozessen. Zunächst wurde eine kleinformatige Bibliothek von Komponenten für das Sporendisplay entworfen und unter Verwendung von fluoreszierenden Proteinen getestet. Im Hinblick auf die Anwendung des Sporendisplays für die Biokatalyse wurde eine kürzlich entdeckte lichtinduzierbare Fettsäure-Decarboxylase aus Chlorella variabilis (CvFAP) auf der Sporenoberfläche präsentiert. Das dargestellte Enzym wurde unter Verwendung von Palmitinsäure als Substrat eingehend charakterisiert. Mit dem Ziel der Gewinnung von Kohlenwasserstoffen aus natürlichen Ölen wurden CvFAP-darstellende Sporen mit Lipase in einer bienzymatischen Kaskade in einem Topf und einem Schritt kombiniert. Bei der Biokonversion wurden Titer bis zu 64 mg/L erzielt. Schließlich wurde die Anwendbarkeit des Sporendisplays für die Produktion von Glykosiden aus dem kostengünstigen Substrat Saccharose getestet. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedene Varianten der Saccharosephosphorylase dargestellt, eine aus Leuconostoc mesenteroides (LmSucP) und die andere aus Bifidobacterium adolescentis (BaSucP). Beide Enzyme wurden auf ihre Effizienz bei der Phosphorolyse von Saccharose zu alpha-D-Glucose-1-phosphat (G1P) und Fructose untersucht. Bei der von LmSucP katalysierten Reaktion wurden nur Spuren von G1P nachgewiesen, während BaSucP bis zu 66 % des Ausgangssubstrats umsetzen konnte.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: xxi, 169 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Computer-aided Synthetic Biology
Date Deposited: 14 Oct 2021 06:47
Last Modified: 14 Oct 2021 06:47
DOI: 10.26083/tuprints-00019729
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-197290
Referees: Kabisch, Prof. Dr. Johannes ; Suess, Prof. Dr. Beatrix
Refereed: 21 May 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19729
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  • Development of a platform for immobilization of proteins based on Bacillus subtilis spores. (deposited 14 Oct 2021 06:47) [Currently Displayed]
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