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Untersuchungen zur Interaktion und Lokalisation von Aquaporinen aus Nicotiana tabacum

Sdorra, Sven :
Untersuchungen zur Interaktion und Lokalisation von Aquaporinen aus Nicotiana tabacum.
TU Darmstadt, Fachbereich Biologie, Angewandte Pflanzenwissenschaften
[Ph.D. Thesis], (2009)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchungen zur Interaktion und Lokalisation von Aquaporinen aus Nicotiana tabacum
Language: German
Abstract:

Aquaporine sind Proteine, die die Diffusion von Wasser oder kleiner, ungeladener Teilchen (wie Glycerin oder Ammoniak) durch biologische Membranen erleichtern. In Pflanzen kommen vier unterschiedliche Aquaporingruppen vor. In dieser Arbeit wurden zwei Vertreter aus der Aquaporingruppe der Plasmamembran Intrinsischen Proteine (PIP) untersucht. Diese lässt sich funktionell in die PIP1-Aquaporine, die die Membranpassage kleiner neutraler Teilchen wie CO2 erleichtern, und PIP2-Aquaporine, die hochselektiv für Wasser sind, unterteilen. Zur Regulation der Wasserdurchlässigkeit von Zellmembranen durch Aquaporine werden verschiedene Mechanismen diskutiert, so z. B. differentielle Genexpression, ein Gating-Mechanismus oder eine kooperative Regulation der Aqauporinpermeabilität durch Heteromerisierung von PIP1- und PIP2-Aquaporinen. Um zu untersuchen, ob PIP1 und PIP2 in vivo in eukaryotischen Plasmamembranen direkt miteinander interagieren, wurde in dieser Arbeit die Methode der Bimolekularen Fluoreszenz-Komplementation verwendet. Hierzu wurden Fusionsproteine aus den Tabak-Aquaporinen NtAQP1 (PIP1) und NtPIP2;1 (PIP2) mit jeweils der N-terminalen bzw. C-terminalen Hälfte von YFP fusioniert und in Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Alle betrachteten Kombinationen (NtAQP1-YC+NtAQP1-YN; NtAQP1-YC+NtPIP2;1-YN; NtPIP2;1-YC+NtPIP2;1-YN;) führten zur Bildung von YFP-Fluoreszenz. Bei allen Kombinationen wurden sowohl Strukturen innerhalb der Zellen als auch die Plasmamembran fluoreszent markiert. Über die Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten konnte die Menge an exprimierten Aquaporinen in den Zellen verglichen werden. Über Kolokalisationsanalyse mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff FM4-64 konnte der relative Anteil der Aquaporine in der Plasmamembran an der Gesamtheit der exprimierten Aquaporine ermittelt werden. Es zeigt sich, dass bei Koexpression von PIP1- und PIP2-Aquaporinen mindestens 3,5 mal mehr Aquaporine in der Plasmamembran gefunden werden als bei der Expression von NtAQP1 oder NtPIP2;1 alleine. Um die Art der Wechselwirkung zwischen den beiden Aquaporinen zu charakterisieren, wurden NtAQP1-YC, NtPIP2;1 und NtAQP1-YC + NtPIP2;1 einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. Es zeigte sich, dass NtAQP1-YC + NtPIP2;1 langsamer als NtPIP2;1 sedimentierte, aber schneller als NtAQP1-YC. Dies ist ein Indiz, dass die beiden verschiedenen Aquaporine miteinander Heterotetramere bilden. Der Einfluss einer Heteromerisierung auf die Wasser- bzw. CO2-Permeabilität der Aquaporine wurde über Stopped Flow Spektrophotometrie bzw. -fluorometrie untersucht. Die Permeabilitäten der Membranen, in die die Aquaporine inseriert wurden, waren durch die Bildung des YFP gegenüber der Permeabiltität von Membranen, in die unfusionierte Proteine integriert waren, erheblich reduziert. Durch Korrelation der ermittelten Permeabilitätskoeffizienten mit dem relativen Anteil der Aquaporine in der Plasmamembran wurde gezeigt, dass die relativ hohe Wasserdurchlässigkeit von Membranen bei Koexpression von PIP1- und PIP2-Aquaporinen aus einem gesteigerten Einbau von PIP2 in die Plasmamembran resultiert. Aber die Wasserpermeabilität der PIP2-Aquaporine in Heteromeren ist im Vergleich zu der in PIP2-Homomeren dramatisch reduziert. PIP1-Aquaporine zeigten keine Wasserleitfähigkeit, ihr Einbau in die Membranen der Hefen scheint allerdings deren Kohlendioxidpermeabilität zu erhöhen. Kommt es bei Koexpression von PIP1 und PIP2 zur Heteromerisierung, so verringert sich dieser Einfluss der Aquaporine auf die CO2-Permeabilität der Plasmamembran ebenso drastisch wie die Wasserpermeabilität der PIP2-Aquaporine bei PIP1-PIP2-Koexpression.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Aquaporins are proteins, that facilitate the diffusion of water or small, uncharched particles (such as glycerol or ammonia) through biological membranes. In plants four groups of aquaporins can be found. In this work two aquaporins of one of these groups, of the Plasmamembrane Intrinsic Proteins (PIP), were investigated. This group can be subdivided into the PIP1-aquaporins, which facilitate the passage of CO2 over membranes, and PIP2-aquaporins, that are highly selective for water. Several mechanisms for the regulation of the water permeability of biological membranes are discussed, such as differential gene expression, a gating mechanism or a cooperative regulation of the aquaporin permeability for water by heteromerisation of PIP1 and PIP2 aquaporins.To investigate, whether PIP1 and PIP2 interact in vivo in eukaryotic plasma membranes directely with each other, Bimolecular Fluorescence-Complementation was used in this work. Therefor fusion proteins of the tabacco aquaporins NtAQP1 (PIP1) and NtPIP2;1 (PIP2) with the respective N-terminal or C-terminal part of YFP were generated and coexpressed in Saccharomyces cerevisiae. All investigated combinations (NtAQP1-YC+NtAQP1-YN; NtAQP1-YC+NtPIP2;1-YN; NtPIP2;1-YC+NtPIP2;1-YN;) lead to the generation of YFP fluorescence. The expression of all investigated combinations of fusion proteins lead to a fluorescent labeling of the plasma membrane as well as of intracellular structures. By the quantification of the fluorescence-intensities the amount of expressed aquaporins in the cells could be compared. By colocalisation analysis with the lipophilic fluorescent dye FM4-64 the relative amount of aquaporins in the plasma membrane could be determined. To characterise the mode of interaction between these two aquaporins, NtAQP1-YC, NtPIP2;1 and NtAQP1-YC + NtPIP2;1 underwent a density gradient ultra centrifugation. NtAQP1-YC + NtPIP2;1 sedimentated slower than NtPIP2;1, but faster than NtAQP1-YC. This indicates, that these two aquaporins form heterotetramers with each other. The influence of this heteromerisation on the water or CO2 permeability of membranes, in which these aquaporins were incorporated, was characterised by stopped flow spectrophotometry or -fluorometry, respectively. The permeabilities of these membranes were tremendously reduced, compared to that of membranes, in which unfused proteins were integrated. Correlation of the determined permeability coefficients and the relative amount of the aquaporins in the plasma membrane showed, that the relatively high water permeability of those membranes, when PIP1 and PIP2 are coexpressed, is due to a high rate of incorporation of PIP1-PIP2 heteromers. Yet a coexpression of both aquaporins lowers the water permeability of PIP2 aquaporins dramatically. PIP1-aquaporins showed only a slight impact on the water permeability, but their incorporation elevates the CO2 permeability of biological membranes. When coexpressed with NtPIP2;1 aquaporins, this influence on the CO2-permeability is lowered to only five percent of the influence of NtAQP1 expressed alone.English
Uncontrolled Keywords: Aquaporin, Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation, Protein-Protein-Interaktion, Regulation der Plasmamembranpermeabilität
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Aquaporin, Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation, Protein-Protein-Interaktion, Regulation der PlasmamembranpermeabilitätGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 580 Pflanzen (Botanik)
Divisions: Biology > Botany > Applied Plant Sciences
Date Deposited: 24 Nov 2009 15:39
Last Modified: 07 Dec 2012 11:56
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-19592
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Kaldenhoff, Prof. Dr. Ralf and Engstler, Prof. Dr. Markus
Refereed: 20 October 2009
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/1959
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