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Einfluss von Kontrastmittel und der applizierten Röntgendosis auf die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen

Grudzenski, Saskia :
Einfluss von Kontrastmittel und der applizierten Röntgendosis auf die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2009)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Einfluss von Kontrastmittel und der applizierten Röntgendosis auf die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen
Language: German
Abstract:

Die Strahlendiagnostik ist die größte künstlich geschaffene Quelle für Röntgenstrahlung im Alltag. DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) sind hierbei die schwerwiegendsten von ionisierender Strahlung (IR) verursachten Läsionen, da sie die genomische Integrität gefährden (UNSCEAR 2000). Bei Computertomographie (CT)-Untersuchungen werden zur Unterstützung der Bildgebung vor der Bestrahlung häufig Kontrastmittel (KM) injiziert, welche Elemente mit einer hohen Ordnungszahl (Z) (z. B. Jod) enthalten und somit die Absorption der Strahlung verstärken. Dies beruht darauf, dass bei Photonenenergien, wie sie in der Röntgendiagnostik eingesetzt werden, bei der Absorption sowohl der Photo- als auch der Comptoneffekt auftritt und die Abhängigkeit der durch den Photoeffekt deponierten Energie von Z sehr hoch ist. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der Frage, ob eine Bestrahlung im Beisein von jodhaltigem KM einen Einfluss auf die DSB-Entstehung hat. In der Röntgendiagnostik werden Röntgendosen von wenigen mGy appliziert. Hierbei werden wenige DSBs induziert, für deren Messung man eine sensitive Methode benötigt. In einer früheren Studie wurde erfolgreich die Methode der Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) in Lymphozyten von CT-Patienten etabliert (Lobrich et al. 2005). Diese erwies sich als sehr sensitiv. Bei klinischen Studien besteht jedoch das Problem, dass sich Patienten in ihrem genetischen Hintergrund unterscheiden, was einen Einfluss auf die gemessenen Effekte haben kann. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit die Sensitivität der IFM unter standardisierten Bedingungen validiert werden. Dazu wurde zunächst in Kooperation mit der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, Universitätsklinikum des Saarlandes in Homburg/Saar die gH2AX-IFM in murinen Lymphozyten etabliert (Rube et al. 2008b). Hierfür wurde die Induktion und Reparatur von DSBs in Lymphozyten verschiedener Mausmutanten mit bekannten Defekten in Komponenten der DSB-Reparatur gemessen. Hierbei spiegelte sich selbst eine geringe Strahlenempfindlichkeit der Mäuse in einer eingeschränkten DSB-Reparaturkapazität wider, sodass sich die IFM als sehr sensitive Methode zur Quantifizierung von DSBs erwies. Nach Validierung der Methode wurde zunächst in vitro die Auswirkung von KM auf die Induktion und Reparatur von DSBs untersucht. Dies wurde mittels gH2AX- und 53BP1-IFM sowie alternativer Methoden wie Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) und premature chromosome condensation (PCC) durchgeführt. Hierbei konnte in primären humanen Lymphozyten und Fibroblasten gezeigt werden, dass die Zugabe von KM vor 90 kV-Röntgenbestrahlung verglichen mit unbehandelten Proben zu einer 40-60%igen Erhöhung der initialen DSB-Anzahl führt (= KM-Effekt). Ohne Bestrahlung hatte KM keinen Einfluss auf die DSB-Entstehung. Um die Abhängigkeit des KM-Effektes von der Photonenenergie zu untersuchen, wurden humane Lymphozyten auch mit 660 kV-g-Strahlung bestrahlt, woraufhin kein KM-Effekt beobachtet wurde. Daraus konnte geschlossen werden, dass die Anwesenheit von KM während 90 kV-Röntgenbestrahlung eine Steigerung des Photoeffektes zur Folge hat, was zu einer erhöhten Induktion von DSBs führt, da nach -Bestrahlung die Energie hauptsächlich durch Comptonelektronen deponiert wird. Da dieser Vorgang unabhängig von Z ist, konnte kein KM-Effekt beobachtet werden. In anschließenden Patientenstudien wurde der KM-Effekt auch in vivo mittels H2AX-IFM an Lymphozyten von CT-Patienten untersucht. Parallel dazu wurde die individuelle in vitro-Reparatur anhand von in vitro-bestrahlten Proben ermittelt. Unter Berücksichtigung der individuellen DSB-Schadensantwort konnte auf diese Weise auch nach in vivo-Bestrahlung eine 20-40%ige Erhöhung der initialen DSB-Anzahl in Anwesenheit von KM beobachtet werden. Da die erste untersuchte Patientengruppe bezüglich der Patientencharakteristika inhomogen war, wurden die Ergebnisse mit einem zweiten unabhängigen CT-Patientenkollektiv verifiziert. Hierbei glichen sich die nativ und die mit KM bestrahlte Vergleichsgruppe im mittleren Alter, in der Altersverteilung innerhalb jeder Gruppe sowie in den klinischen Indikationen. Die Messungen ergaben auch hier eine signifikante Erhöhung der Anzahl an induzierten DSBs von 33% bei CT-Patienten mit KM-Gabe, sodass die in vivo-Daten der ersten Patientengruppe verifiziert werden konnten. In den o. g. Patientenstudien traten große Unterschiede im individuellen Reparaturverhalten auf. Daher wurde im weiteren Verlauf der Arbeit untersucht, ob die Reparaturkapazität von den Faktoren Alter, klinischer Indikation oder dem Geschlecht beeinflusst wird. Sowohl im ersten als auch in einer dritten Patientengruppe konnte gezeigt werden, dass Patienten über 60 Jahre eine verminderte DSB-Reparaturkapazität gegenüber jüngeren Patienten (im Mittel 30 Jahre) aufweisen. Weiterhin zeigten Frauen ein tendenziell schlechteres Reparaturvermögen als Männer. Dagegen ergab ein Vergleich der klinischen Indikationen keine Unterschiede. Eine frühere Studie konnte beobachten, dass in konfluenten Fibroblasten die DSB-Reparaturkapazität in vitro mit niedriger werdender Röntgendosis abnimmt und nicht-reparierte DSBs verbleiben (Rothkamm & Lobrich 2003). Um die physiologische Relevanz zu untersuchen, wurde daher im Rahmen dieser Arbeit das Reparaturvermögen im Niedrigdosisbereich auch in vivo in verschiedenen Mausgeweben untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die DSB-Reparatureffizienz auch in vivo konsistent zu den bisherigen in vitro-Daten nach einer Niedrigdosis von 10 mGy verglichen mit höheren Dosen abnimmt. Nachdem die Daten von Rothkamm & Lobrich (2003) in vitro in konfluenten Fibroblasten mit zusätzlichen Röntgendosen und zwei DSB-Markern bestätigt wurden, wurde versucht, ein besseres Verständnis für die Ursache von nicht-reparierten DSBs zu erlangen. Hierfür wurde mittels H2O2-Behandlung vor Röntgenbestrahlung der oxidative Stress in den Zellen erhöht, was zur Reparatur aller strahleninduzierten DSBs führte. Dies lässt vermuten, dass durch eine Erhöhung des oxidativen Stresses in der Zelle die DSB-Reparatur stimuliert wird.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Diagnostic X-rays are the largest man-made source of radiation exposure. They induce DNA double-strand breaks (DSBs) which are the most relevant biological damage induced by ionizing radiation (IR) as they compromise the genomic integrity (UNSCEAR 2000). Very often, contrast media (CM) are used to improve the visibility of internal body structures with similar densities in an X-ray image. Contrast media contain elements with high atomic numbers as iodine which increase the absorption of radiation. When photon radiation interacts with cells, secondary electrons are emitted by either the photoelectric or the Compton effect. At photon energies that are used during diagnostic X-ray examinations, the photoelectric effect is the predominant process that generates secondary electrons. The number of electrons emitted by this effect strongly depends on the atomic number (Z) of the irradiated matter (~Z4). The first part of this work aimed to investigate if iodinated CM influences the DSB induction after X-irradiation. In radiation diagnostics low dose exposure in the range of few mGy is applied. DSB levels induced by these doses are very low. The methods for the assessment of DSBs have to be very sensitive. In a past study in which gH2AX-IFM (immune fluorescence microscopy) could be established successfully in lymphocytes of CT patients, this method proved to be very sensitive (Lobrich et al. 2005). As patients often differ in their genetic background, this can have an influence on the measured effects. To validate the sensitivity of this method under controlled conditions, the IFM was established in lymphocytes of different mouse mutants with known defects in DSB repair components. This happened in collaboration with the Department of Radiooncology, Saarland University, Homburg/Saar (Rube et al. 2008b). The ability to measure even slight differences in DSB repair pointed out the high sensitivity and suitability of this approach for the investigation of DSB induction and repair. Following in vitro experiments to assess the influence of CM on the DSB induction included gH2AX- and 53BP1-IFM and alternative methods like pulsed field gel electrophoresis and premature chromosome condensation. Therefore primary human lymphocytes and fibroblasts were irradiated in the presence or absence of CM. Thereby, CM administration prior to irradiation with 90 kV X-rays led to a dose-dependent increase of the initial amount of DSBs and chromosome breaks by approximately 40-60%. The administration of CM after irradiation had no effect. To investigate the dependence of this effect on the applicated dose and the photon energy, additional experiments with lymphocytes were performed using 660 kV-g-rays. After g-ray exposure CM had no effect on the DSB induction. g-rays predominantly interact with matter through the Compton effect. The number of emitted Compton electrons by this effect is independent of Z. This suggests that the presence of iodine during X-irradiation increases the yield of DSBs in irradiated cells because of the higher X-ray absorption due to increased photoelectric interaction. To investigate the CM effect in vivo, the amount of gH2AX-foci was quantified in lymphocytes of individuals undergoing CT examinations with or without CM administration. Considering the individual repair capacity of each patient by comparing his in vivo data with individual in vitro data, the results obtained in vivo showed that a CM administration prior to CT examination leads to an increase of DSBs in the lymphocytes of patients of approximately 30%. As the first group of patients showed great inter-individual variation in the level of DSB repair, and to confirm the recent findings, a second independent CT patient group was evaluated. To avoid inter-individual variation, this patient group was matched in age and health status. Foci numbers assessed in vivo after CT confirmed the findings that CM leads to an increase in the induction of DSBs by X-irradiation. Because there were substantial differences in DSB repair between individuals, further investigations were performed in order to identify factors which influence DSB repair. Therefore, patients of the first and of a new third patient group were compared in age, health status and gender and analyzed by their DSB repair behaviour. The results revealed a diminished repair capacity for patients older than 60 years compared to younger patients with a mean age of 30 years. Furthermore, women showed a slightly diminished DSB repair capacity compared to men. In contrast, the health status did not influence DSB repair. This suggests that a person’s age and perhaps also gender may affect the individual DSB repair capacity. A former work of Rothkamm & Lobrich (2003) with confluent wild-type fibroblasts reported that DSB repair becomes less efficient with decreasing radiation doses and that a subset of DSBs remains unrepaired. To examine the physiological relevance of these results, subsequent low dose studies were performed in different mouse tissues of repair proficient wild-type mice. Using gH2AX and 53BP1 as DSB markers, it could be seen for the first time that consistent to the previous findings in vitro, DSB repair after a dose of 10 mGy is less efficient compared with higher doses in vivo and that a subset of DSBs remains unrepaired after irradiation. After approving the data of Rothkamm & Lobrich (2003) with confluent wild-type fibroblasts, but with additional radiation doses and two DSB markers (gH2AX and pATM), further investigations should improve our understanding for the reasons of DSBs remaining unrepaired after X-ray irradiation. Therefore confluent wild-type fibroblasts were treated with H2O2 before irradiation to enhance cellular oxidative stress. Following DSB repair studies revealed that H2O2 pretreated cells exhibited a better DSB repair capacity than untreated cells. These results led to the conclusion that oxidative stress has an impact on the efficiency of DSB repair.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Zoology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 17 Nov 2009 11:16
Last Modified: 07 Dec 2012 11:56
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-19565
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Identification Number: D 17
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 27 October 2009
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/1956
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