TU Darmstadt / ULB / TUprints

Cytosine Base Modifications, DNA Metabolism and Development

Rausch, Cathia (2021):
Cytosine Base Modifications, DNA Metabolism and Development. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00019518,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Cytosine Base Modifications, DNA Metabolism and Development
Language: English
Abstract:

While the basic composition of the DNA double helix is known for decades, there is increasing evidence for the stable presence of modified DNA bases in the genome. It is also well known that the majority of our genetic material consists of non-coding and repeat DNA which have important functions in genome regulation, maintenance and organization. Importantly, to avert genome instability through the process of (epi)genome duplication, the underlying processes are tightly regulated in space and time. Whereas many studies correlate replication timing and chromatin landscapes of non-repeat DNA, repetitive regions are difficult to map and, thus, are commonly excluded in genome-wide assays. To overcome this drawback, we developed a protocol to simultaneously visualize DNA replication (or DNA repair) and specific DNA repeat elements in individual and structurally intact 3-dimensional cell nuclei (Repli-FISH). Making use of this single cell microscopy approach in human somatic cells, we find that the euchromatic Alu element (short interspersed nuclear element (SINE)) is replicated early during the synthesis (S-) phase, while the pericentromeric satellite III is exclusively replicated in late S-phase. Long interspersed nuclear element 1 (LINE-1) replication, though, is performed throughout S-phase. Together with available population genomics analyses, we demonstrate that the majority of LINE-1 elements is duplicated according to their distinct histone modifications. In contrast, pericentromeric heterochromatin (chromocenters) in mouse embryonic stem (mES) cells is replicated during early/mid S-phase (stage II). Similarly, minor satellite and p-arm telomeres are also duplicated during this timeframe, as a consequence of a domino-like replication propagation. We find that this shifted replication timing depends on an increased level of histone acetylation and a more open chromocenter structure. Likewise, we unveil a synchronous replication of the Y chromosome at the end of S-phase, independently of the pluripotency state of the cell. We additionally investigated the properties of the mES cell replicon, i.e. the DNA replicated from one origin, and the number of active replication sites. By combining genome-wide origin mapping, single-molecule analysis and super-resolution microscopy (3D-SIM), we demonstrate that each replication focus visualized by 3D-SIM corresponds to an individual replicon. Moreover, up to one quarter of the foci represent unidirectional forks. Furthermore, mES cell replicons are smaller than in somatic cells, resulting from the activation of twice as many origins spaced at half the distance, highlighting fundamental developmental differences in genome replication organization in pluripotent cells. In the light of the dramatic effects of histone acetylation level changes on DNA replication, we investigated the influence of cytosine modifications on nuclear processes. We, therefore, established cellular systems to modulate the extent of cytosine variants. Those were based on changing the expression levels of modification writer enzymes, as well as on transfection of modified nucleotides into cells. We find highest DNA duplex stabilities for methylated DNA (5mC) in vitro and in vivo. This effect is reverted by all oxidized cytosine variants. Accordingly, we find enhanced transcription, replication and DNA unwinding rates in the presence of the destabilizing 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) and the absence of the stabilizing 5mC. We show that mES cells deficient of 5mC pass more rapidly through S-phase stage II and, consistently, have faster replication forks. These observations are not the result of altered chromatin condensation, structure, accessibility or histone marks and we conclude that the absence of 5mC enhances DNA unwinding and consequently DNA replication. Thereby, modified cytosines may constitute a mechanism for local fine-tuning of DNA processes. In summary, our data contribute to a better understanding of different levels of epigenetic regulation involved in nuclear metabolic processes.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Während die grundlegende Zusammensetzung der DNA-Doppelhelix seit Jahrzehnten bekannt ist, mehren sich die Hinweise auf das stabile Vorhandensein von modifizierten DNA Basen im Genom. Ebenso ist bekannt, dass der Großteil unseres genetischen Materials aus nicht-kodierender und sich wiederholender DNA besteht, die wichtige Funktionen in der Regulierung, Erhaltung und Organisation des Genoms haben. Zur Vermeidung von Genominstabilität durch den Prozess der (Epi-)Genomverdopplung werden die zugrunde liegenden Prozesse räumlich und zeitlich eng reguliert. Während viele Studien den Replikationszeitpunkt und die Chromatinlandschaften von nicht-repetitiver DNA analysieren, sind ’repeat’ Regionen schwer zu sequenzieren und zuzuordnen, und werden daher in genomweiten Studien häufig ausgeschlossen. Um diesen Nachteil zu überwinden, haben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung von spezifischen DNA Repeat-Elementen und DNA Replikation (oder Reparatur) in einzelnen und strukturell intakten 3-dimensionalen Zellkernen (Repli-FISH), entwickelt. Unter Verwendung dieses einzelzellmikroskopischen Ansatzes in menschlichen somatischen Zellen zeigen wir, dass das euchromatische Alu-Element (short interspersed nuclear element (SINE)) in der frühen Synthese (S-) Phase repliziert wird, während der pericentromerische Satellit III ausschließlich in der späten S-Phase repliziert wird. Die Replikation des ’long interspersed nuclear element’ 1 (LINE-1) wird jedoch während der gesamten S-Phase durchgeführt. Der Zusammenschluss von Genomdaten und unserer Einzelzellmikroskopie weist darauf hin, dass die meisten LINE-1 Elemente entsprechend ihrer jeweiligen Histonmodifikationen dupliziert werden. Im Gegensatz dazu wird das perizentromere Heterochromatin in embryonalen Stammzellen (mES) der Maus während der frühen/mittleren S-Phase (Stadium II) repliziert. In ähnlicher Weise werden in diesem Zeitraum auch Mikrosatelliten DNA und Telomere auf dem chromosomalen p-Arm dupliziert, was wir auf eine domino-ähnliche Aktivierung von Replikationsursprüngen zurückführen. Wir zeigen, dass dieser versetzte Replikationszeitpunkt von einem erhöhten Histonacetylierungsniveau und einer offeneren Chromocenterstruktur abhängt. Ebenso beobachten wir eine synchrone Replikation des Y Chromosoms, die unabhängig vom Pluripotenzzustand der Zelle das Ende der S-Phase markiert. Wir untersuchten zusätzlich die Eigenschaften des mES-Zellreplikons, d.h. der DNA, die von einem Ursprung ausgehend repliziert wird, und die Anzahl der aktiven Replikationsorte. Durch eine Kombination aus genomweiter Kartierung von Replikationsursprüngen, Einzelmolekül- und hochauflösender Mikroskopie (3D-SIM) zeigen wir, dass jeder Replikationsfokus, der durch 3D-SIM visualisiert wird, einem einzelnen Replikon entspricht. Darüber hinaus stellen bis zu einem Viertel der Foci unidirektionale Replikationsgabeln dar. Des Weiteren sind die Replikons von Stammzellen kleiner als die in somatischen Zellen, was auf die Aktivierung von doppelt so vielen Replikationsursprüngen die in halber Entfernung voneinander angeordnet sind, zurückzuführen ist. Angesichts der dramatischen Auswirkungen von Veränderungen der Histonacetylierunglevel auf die DNA Replikation untersuchten wir zusätzlich den Einfluss von Cytosin-Modifikationen auf metabolische Kernprozesse. Wir etablierten daher zelluläre Systeme zur Modulation der Menge an modifizierten Cytosinen. Diese basieren auf der Veränderung der Expression von Enzymen, die die Modifikationen anlegen, sowie auf der Transfektion von modifizierten Nukleotiden in Zellen. Wir messen die höchsten Duplex-Stabilitäten für methylierte DNA (5mC), in vitro und in vivo. Dieser Effekt wird von allen oxidierten Cytosin-Varianten aufgehoben. Dementsprechend finden wir höhere Transkriptions-, Replikations- und DNA-Abwicklungsraten in Gegenwart des destabilisierenden 5-Hydroxymethylcytosins (5hmC) und in Abwesenheit des stabilisierenden 5mC. Wir zeigen, dass mES-Zellen, denen 5mC fehlt, das S-Phasen-Stadium II schneller durchlaufen und folgerichtig schnellere Replikationsgabeln aufweisen. Diese Beobachtungen sind nicht das Ergebnis einer veränderten Chromatinkondensation, -struktur, -zugänglichkeit oder -histonlandschaft. Alles in allem kommen wir zu dem Schluss, dass das Fehlen von 5mC die DNA Entwindung und folglich die DNA Replikation und Transkription beschleunigt. Daher könnten modifizierte Cytosine einen Mechanismus für die lokale Feinabstimmung von DNA-Prozessen darstellen. Zusammenfassend tragen unsere Daten zu einem besseren Verständnis der verschiedenen Ebenen der epigenetischen Regulation bei, die an Kern-assoziierten Stoffwechselprozessen beteiligt sind.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: vi, 312 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
TU-Projects: DFG|CA198/12-1|Einfluss von DNA-Bas
DFG|SFB1361,TP06|TP_06_Cardoso_Mainz
Date Deposited: 21 Sep 2021 10:44
Last Modified: 21 Sep 2021 10:44
DOI: 10.26083/tuprints-00019518
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-195185
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina ; Nuber, Prof. Dr. Ulrike A.
Refereed: 14 September 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19518
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