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Identifizierung von Zelleintrittsinhibitoren der Ebolavirus-Infektion und die Optimierung eines Impfvektors

Atgé Martin, Judith (2021):
Identifizierung von Zelleintrittsinhibitoren der Ebolavirus-Infektion und die Optimierung eines Impfvektors. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00019260,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Identifizierung von Zelleintrittsinhibitoren der Ebolavirus-Infektion und die Optimierung eines Impfvektors
Language: German
Abstract:

Eine Infektion mit dem Ebolavirus ist eine der tödlichsten Viruserkrankungen für den Menschen. Während des großen Ebolavirus-Ausbruchs der Jahre 2014 bis 2016 in Westafrika starben schätzungsweise 11 000 von 23 000 Infizierten. Bis heute kommt es immer wieder zu Ebolavirus-Ausbrüchen in der Demokratischen Republik Kongo. Hohe Ansteckungsraten und fehlende Therapiemöglichkeiten führten zu Mortalitätsraten bis zu 50% im Durchschnitt (WHO, 2020). Zunehmende Globalisierung und Mobilität der Menschen haben außerdem zur Folge, dass Ausbrüche des Ebolavirus nicht länger lokal begrenzt bleiben, sondern auch eine Verbreitung über mehrere Kontinente ermöglichen. Forscher fokussieren im Kampf gegen virale Krankheiten auf antivirale Therapeutika und Impfstoffe. Auch in der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf diese beiden Ansätze gelegt. Während zwei Ebolavirus-Impfstoffe seit 2020 zugelassen sind, konnten noch keine Therapeutika basierend auf kleinen Molekülen/Peptiden identifiziert werden, die eine Bindung des Ebolavirus an Zellen unterdrücken. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine Hämofiltrat-Peptidbibliothek mithilfe von lentiviralen pseudotypisierten Ebolavirus-Vektorpartikeln mit einem Luziferase-Reportergen auf Zelleintrittshemer durchsucht. Innerhalb der 384 verschiedenen Peptidfraktionen konnten 5 verschiedene Peptidfraktionen als potentielle Ebolavirus-Zelleintrittshemmer identifiziert werden. Allerdings stellten sich diese Peptidfraktionen nach genaueren Analysen als Luziferase-hemmende Peptide heraus. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Optimierung des Impfvektors Modifiziertes Vakziniavirus Ankara (Modified Vaccinia Ankara-MVA). MVA ist ein etablierter und sicherer Impfvektor, dessen Wirksamkeit gegen zahlreiche Viren seit langem genutzt wurde. In humanen dendritischen Zellen synthetisiert MVA aber keine späten Genprodukte. Dies könnte an dem antiviralen Protein SAM Domäne und HD-Domäne beinhaltendes Protein 1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1-SAMHD1) liegen. SAMHD1 reduziert den Pool an Deoxyribonukleotid-Triphosphaten im Zytoplasma von antigenpräsentierenden Zellen (antigen-presentating cells-APC) und damit die Neusynthese der viralen DNA. Die DNA-Replikation wird aber zur Expression von späten MVA-Genen bzw. den heterologen Antigenen benötigt, die unter starken späten MVA-Promotoren exprimiert werden. Ist die DNA-Replikation in APCs wiederhergestellt, kann die Expression später MVA-Gene bzw. der Antigene unter späten starken Promotoren stattfinden und diese somit direkt über den Haupthistokompatibilitätskomplex (Major compatibility complex-MHC) den T-Zellen präsentiert werden. Diese Wiederherstellung der DNA-Replikation kann durch den Abbau von SAMHD1 erfolgen. Virale Proteine wie das von HIV-2 und SIV exprimierte virale Protein x (virale Protein x-Vpx) sind bekannt dafür, SAMHD1 dem proteosomalen Abbau zuzuführen. Aus diesem Grund wurde in Vorarbeiten das SIV vpx Gen in das MVA-Genom eingeführt und folglich MVA-Vpx genannt. Für die Untersuchung der Vpx-Funktion wurden humane dendritische Zellen mit MVA-Vpx infiziert. Es konnte gezeigt werden, dass mit MVA-Vpx die DNA-Replikation, aber auch die späte Genexpression in humanen dendritischen Zellen wiederhergestellt werden kann. Da die späte Geenexpression zu einer verbesserten Vektorimmunogenität führen kann, erfolgten in dieser Arbeit vergleichende immunologische Untersuchungen. Diese beinhalteten die Reifung von MVA-Vpx-infizierten humanen dendritischen Zellen, welche anhand der CD80 (Cluster of Differentiation-CD), CD86-, MHCI- und MHCII-Expression, sowie der Sekretion der Zytokine Interleukin (IL)-6 und Tumor-Nekrose Faktor-(TNF)α untersucht wurde. Weitere vergleichende immunologische Untersuchungen erfolgten im Bezug auf die Interferonantwort. Zusätzlich wurde auch das Auslösen der Apoptose durch MVA-Vpx infizierte humane dendritische Zellen untersucht. Es deuteten sich Unterschiede in der Reifung von MVA-Vpx-infizierten und MVA-infizierten dendritischen Zellen an. Während es scheinbar Unterschiede bei der CD80 - und CD86-Expression zwischen MVA und MVA-Vpx infizierten humanen dendritischen Zellen gibt, scheint die MHC I -und MHC II-Expression ähnlich hoch zu sein. In der IL-6 und TNFα-Sekretion von MVA-Vpx-infizierten humanen dendritischen Zellen gab es keinen Unterscheid zu jener von MVA-infizierten humanen dendritischen Zellen. Die Apoptose wurde in MVA-Vpx-infizierten humanen dendritischen Zellen ähnlich schnell ausgelöst wie durch MVA-infizierte humane dendritische Zellen. Allerdings zeigten die Untersuchungen zur Interferonantwort Unterschiede. Die Interferon α - und – ß -Sekretion nach MVA-Vpx-Infektion von humanen dendritischen Zellen war deutlich reduziert zu jener Sekretion durch eine MVA-Infektion. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass in der vorliegenden Arbeit innerhalb der Peptidbibliothek aus humanen Hämolfiltrats kein Ebolavirus-Zelleintrittshemmer identifiziert werden konnte. Dennoch konnte die vorliegende Arbeit Einblicke in die Funktion des Impfvektors MVA-Vpx geben.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Ebola virus disease (EVD) is one of the deadliest infectious disease in the world. The large 2014 - 2016 EVD outbreak resulted in over 23 000 infections including at least 11 000 deaths. To this day there are still ongoing EVD outbreaks, mostly confined to the Democratic Republic of Congo. The high infection rate and lack of treatment led to a mortality rate of up to 50% during the big 2014 - 2016 outbreak (WHO, 2020). Additionally, globalisation and mobility of people could spread the virus to other continents such as Europe or America. To fight viral diseases researchers focus on developing antiviral therapeutics and vaccination, therefore both approaches were covered in this thesis. Since 2020 two different vaccines have been used against the Ebola virus. However, there is no therapeutic method with small molecules yet available to inhibit cell entry of the virus. A peptide library originated from human hemofiltrates was therefore screened with pseudotyped Ebola virus lentiviral particles for neutralizing activities. However, no Ebola virus cell entry inhibitor could be detected in the 384 peptide fractions tested. Positive hits were only inhibitors of luciferase enzymatic activity, which was used as a readout. The second approach of this thesis was the optimisation of the viral vector Modified Vaccinia Ankara (MVA), which is already under development as recombinant vector vaccine against different virus infections but MVA does not produce late viral proteins in human dendritic cells. This could be linked to the antivirale Protein SAM domain and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1). SAMHD1 is a cellular enzyme which reduces the dNTP pool in antigen-presenting cells (APCs) such as dendritic cells, thereby restricting the synthesis of new viral DNA. Given the cascade-like replication cycle of MVA, DNA replication is needed to express late MVA genes or rather the heterologous antigens expressed under strong late MVA promoters. If DNA replication in dendritic cells is blocked, heterologous genes under strong late MVA promoters are not expressed and consequently the corresponding antigens cannot be presented through the MHC class proteins to T-cells. However, degradation of SAMHD1 could result in a recovery of DNA replication. The viral protein Vpx of HIV2 and SIV is one of the proteins known to promote the degradation of SAMHD1. For this reason, in initial work the SIV vpx gene was introduced into the MVA genome and the resulting virus was named MVA-Vpx. To investigate the function of Vpx in the MVA genome, human dendritic cells were infected with MVA-Vpx. MVA-Vpx infection resulted in SAMHD1 protein degradation and enabled MVA-Vpx to replicate its DNA genome and to express genes controlled by late promoters. As late gene expression might enhance vector immunity, maturation markers of human dendritic cells were first analysed. While CD80 and CD86 expression seems to be lower in MVA-Vpx-infected human dendritic cells than in MVA-infected human dendritic cells, the expression of MHC I and MHC II seems to be similar. No difference in the secretion of IL6 and TNFα between MVA- and MVA-Vpx-infected human dendritic cells could be detected. Also, no difference was determined in the triggering of apoptosis after MVA-Vpx infection compared to MVA infection. Surprisingly, the type I interferon secretion induced by MVA infection was blocked by vpx expression. In this thesis no Ebola virus specific entry inhibitor could be identified but it still gives insights into the function of the new vector vaccine MVA-Vpx.

English
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VIII, 170 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Ribogenetics
Date Deposited: 10 Sep 2021 12:15
Last Modified: 10 Sep 2021 12:15
DOI: 10.26083/tuprints-00019260
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-192605
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix ; Schnierle, Prof. Dr. Barbara
Refereed: 30 July 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19260
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