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Untersuchungen zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in der G2-Phase des Zellzyklus

Beucher, Andrea :
Untersuchungen zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in der G2-Phase des Zellzyklus.
TU Darmstadt: Zoologie
[Ph.D. Thesis], (2009)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchungen zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in der G2-Phase des Zellzyklus
Language: German
Abstract:

Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung des Beitrags der verfügbaren Wege zur Reparatur von strahlen- und etoposidinduzierten DNA-Schäden in der G2-Phase des Zellzyklus. Hier stehen zwei Hauptreparaturwege zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) zur Verfügung. Die Homologe Rekombination (HR) ermöglicht durch Sequenzabgleich mit homologen DNA-Regionen die fehlerfreie Reparatur des DNA-Schadens. Das NHEJ beruht auf der einfachen Verknüpfung von freien DNA-Enden. Die Reparatur erfolgt sehr schnell, allerdings birgt dieser Reparaturweg das Risiko von Mikrodeletionen und verläuft somit nicht zwangsweise fehlerfrei. Die Nuklease Artemis und die Proteinkinase ATM sind für die Reparatur einer Subpopulation strahleninduzierter DNA-Schäden von Bedeutung. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von heterozygoten Mutationen der DNA-Reparaturfaktoren BRCA1 und BRCA2, die mit einer erblichen Prädisposition für Brustkrebs in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung des Reparaturvermögens stationärer BRCA1- bzw. BRCA2-Mutanten konnte keine Einschränkung der DNA-Reparatur nach ionisierender Bestrahlung (IR) nachweisen. Dieses Ergebnis wurde durch die Analyse von G1-Phase-Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur bestätigt. Auch in der G2-Phase hat eine heterozygote Mutation in BRCA1 keinen Einfluss auf die Reparaturkapazität der betroffenen Zellen. Die Aktivität des vorhandenen Restproteins scheint für eine vollständige Reparatur auszureichen. Dagegen führt eine heterozygote Mutation in BRCA2 zu einer Verminderung der DSB-Reparatur in der G2-Phase und resultiert in einem Defekt der langsamen Reparaturkomponente. Allerdings zeigen die untersuchten Mutanten trotz identischer Mutationen ein sehr heterogenes Reparaturverhalten, was einen Einfluss des genetischen Hintergrunds nahe legt. Aufgrund der geringen Kohortengröße der untersuchten Zelllinien und der in der Literatur kontrovers diskutierten Situation ist eine Beurteilung des Einflusses heterozygoter Mutationen in BRCA1 bzw. BRCA2 auf Basis der durchgeführten Experimente nicht abschließend möglich. Die Charakterisierung der homozygot defekten BRCA2-Mutante konnte eine Beteiligung der HR an der Reparatur strahleninduzierter DSBs in der G2-Phase nachweisen. Defekte in der HR betreffen ebenso wie Defizienzen in ATM und Artemis die langsame Komponente der Reparatur. Die Ähnlichkeiten in Verlauf der Reparaturkinetik und im Ausmaß des Reparaturdefekts von BRCA2-, ATM- und Artemis-defizienten Zellen eröffnet die Möglichkeit der Beteiligung dieser Reparaturfaktoren an einem gemeinsamen Reparaturweg. Epistasisanalysen mit einem spezifischen ATM-Inhibitor bestätigen diese Vermutung. BRCA2 ist ein etablierter HR-Faktor, wodurch ATM und Artemis in der G2-Phase mit der HR in Zusammenhang gebracht werden. Dieses Ergebnis ist sehr überraschend, da die ATM/Artemis-abhängige Reparatur in G1 als Unterweg des DNA-PK-abhängigen NHEJ betrachtet wird. Dagegen verläuft die Reparatur dieser Schäden in der G2-Phase unabhängig von funktionaler DNA-PK über den Reparaturweg der HR, wie durch Epistasisanalysen mit einem Inhibitor der DNA-PKcs gezeigt werden konnte. Somit wird der Großteil der IR induzierten DSBs sowohl in G1 wie auch in G2 durch die schnelle Komponente des NHEJ repariert. Die Reparaturfaktoren ATM und Artemis werden für die langsame Reparatur einer Subfraktion der strahleninduzierten DSBs benötigt. Diese werden in der G1-Phase unter Beteiligung funktionaler DNA-PK über NHEJ repariert, während die Reparatur in G2 DNA-PK-unabhängig durch HR fortgeführt wird. Der Heterochromatinanteil in humanen Zellen korreliert sehr gut mit dem Ausmaß der ATM/Artemis-abhängigen Reparatur. Dies könnte darauf hindeuten, dass heterochromatinassoziierte DSBs aufgrund ihrer Lokalisation zur erfolgreichen Reparatur ATM und Artemis benötigen. Die Funktion von ATM könnte in der Auflösung der dichtgepackten Heterochromatinstruktur liegen, wurde jedoch in dieser Arbeit nicht weiter untersucht. Die Rolle von Artemis wurde in Komplementationsexperimenten mit verschiedenen Artemis-Konstrukten charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Endonukleasefunktion von Artemis für eine vollständige Reparatur unabdingbar ist. Die Tatsache, dass etoposidinduzierte DNA-Schäden eine deutlich geringere Beteiligung von ATM und Artemis zeigen, deutet darauf hin, dass auch die Komplexität eines DNA-Schadens Einfluss auf die Reparatur hat. Chemisch induzierte DSBs weisen eine einheitliche, unkomplizierte Struktur auf und können aus diesem Grund ohne Beteiligung von ATM und Artemis auch im Heterochromatin durch NHEJ repariert werden. Dagegen könnte bei IR-induzierten DNA-Schäden die Struktur der DSBs in Kombination mit der Lokalisation des Bruchs die Abhängigkeit von ATM und Artemis bedingen. Sowohl die Lokalisation des DSBs im Heterochromatin wie auch die Komplexität eines DSBs führen zu einer Verzögerung der Reparatur. Möglicherweise entstehen während dieser Zeit, die der DSB in unrepariertem Zustand verbleibt, sekundäre Strukturen, die durch Artemis bearbeitet werden müssen. Nach der Bearbeitung durch ATM und Artemis werden die entsprechenden DNA-Schäden in G2 der HR zugeführt. Dies deutet darauf hin, dass diese Strukturen in frühen Bearbeitungsschritten der HR enstehen, unbearbeitet die Reparatur verhindern und den Bruch für die HR markieren. In der G1-Phase, in der keine HR zur Verfügung steht, müssen diese DNA-Schäden unter Beteiligung der DNA-PK über NHEJ repariert werden, während DNA-PK die Reparatur der anderen durch NHEJ reparierten DNA-Schäden lediglich erleichtert. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Reparatur von etoposidinduzierten, kovalent verknüpften DNA-Protein-Komplexen untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine direkte Beteiligung des MRN-Komplexes an der Reparatur dieser DNA-Schäden in der G1-Phase. Dabei ist vermutlich die Endonukleaseaktivität des Proteinkomplexes für die Entfernung des verknüpften Proteins mitsamt eines kurzen DNA-Fragments verantwortlich. Die entstehenden freien Enden können anschließend durch NHEJ verknüpft werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte Einblick in das komplexe Zusammenspiel der unterschiedlichen Reparaturwege in der G2-Phase des Zellzyklus gewonnen werden. Der Beitrag der HR zur Reparatur von DNA-Schäden konnte quantifiziert und der langsamen Komponente der Reparatur zugeordnet werden. Diese ist für die ATM/Artemis-abhängige Reparatur von DNA-Schäden zuständig, die in G1 durch DNA-PK-abhängiges NHEJ repariert werden, während in G2 die HR angeschlossen wird. Über die Faktoren, die den Bedarf an ATM und Artemis bedingen, konnten nur Vermutungen angestellt werden. Diese Aspekte sind allerdings noch nicht vollständig verstanden und sollten in zukünftigen Arbeiten weiter untersucht werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
This work addresses the contribution of different repair pathways available in G2 to the repair of DNA double strand breaks (DSBs). Repair in G2 involves two major pathways. Homologous recombination allows error-free repair by resynthesizing the damaged sequence information using a homologous template. The non-homologous end joining (NHEJ) pathway acts in a template independent fashion by rejoining the broken ends of a DSB. Repair is very fast but error-prone and at risk of microdeletions. The nuclease Artemis and the kinase ATM are involved in the repair of a subfraction of IR-induced DSBs. The first part of this work deals with the effect of heterozygous mutations in the repair factors BRCA1 and BRCA2 which account for an inherited predisposition for breast cancer. Confluent BRCA mutants do not show an impaired repair capacity after IR. This result is confirmed by analysis of DSB repair in the G1 phase of exponentially growing cells. Heterozygous mutations in BRCA1 do not have any effect on G2 phase cells as well. The amount of wildtype (WT) protein seems to suffice for accurate DNA repair. However, a heterozygous BRCA2-status reduces the repair capacity and leads to a repair defect of the slow component. Even though all analysed cell lines exhibit the same mutation there are enormous differences among them. These results suggest the influence of the genetic background on DSB repair. The influence of heterozygous mutations of BRCA1 and BRCA2 on DSB repair is discussed controversially in the literature. But the number of mutant cell lines analysed in this work is too small to draw a final conclusion. Repair kinetics of cells with a homozygous mutation in BRCA2 revealed the contribution of HR to DSB repair during G2 phase. Defects in HR components as well as defects in ATM and Artemis diminish the repair capacity of the slow component. The striking similarity in the repair kinetics of BRCA2-, ATM- and Artemis-deficient cells raised the possibility that the three repair factors participate in one joint repair pathway. Epistasis analysis with a specific ATM inhibitor confirmed this notion. BRCA2´s role in HR is well documented and these results link ATM and Artemis to the HR pathway. This conclusion is very surprising because ATM/Artemis dependent repair is regarded as a subpathway of NHEJ in G1 phase. In G2 the repair of these breaks is completely different and involves the HR pathway without reliance on functional DNA-PK as was shown by epistasis analysis using a specific inhibtitor of DNA-PKcs. The fast component removes the majority of IR-induced DSBs by NHEJ in G1 and G2. The slow component involves ATM and Artemis and is responsible for the repair of a subfraction of IR-induced DSBs. In G1 the repair of these breaks is channeled into NHEJ involving DNA-PK whereas in G2 the HR pathway removes the DSBs without reliance on functional DNA-PK. The fraction of DSBs that requires ATM and Artemis for successful repair shows a nice correlation with the amount of heterochromatin in human cells. This suggests that the ATM/Artemis dependency of a DSB results from its localisation in heterochromatin. ATM may be involved in chromatin relaxation but the role of ATM was not further investigated in this work. Complementation experiments with different variants of Artemis revealed the importance of Artemis´ endonuclease activity for proper DNA repair and gave insight into the function of Artemis in HR-mediated repair. The fact that etoposide-induced DSBs show a diminished ATM/Artemis defect suggests that factors like complexity may also have influence on the repair pathway choice. DSBs induced by chemicals like etoposide show the same structure without complicated modifications and are repaired with fast kinetics using NHEJ even in heterochromatin. In contrast, IR induces a spectrum of DSBs with various modifications that could account for the dependency on ATM and Artemis in addition to heterochromatin association. The localisation of a DSB as well as its complexity prevents the fast rejoining of DSB ends. This retardation possibly contributes to the formation of secondary strucures or lesions that may need the processing of Artemis before religation can occur. The repair of ATM/Artemis dependent DSBs is accomplished using HR in G2. This may suggest that structures requiring the activity of ATM and Artemis arise during early steps of the HR process. The repair of this DSB is impaired and marked for HR mediated repair. In G1, where HR is not available, modified DSBs are repaired using DNA-PK dependent NHEJ whereas DNA-PK plays merely a facilitating role in the repair of the majority of IR induced DSBs. The last part of this work investigates the repair of etoposide-induced DSBs with covalently linked protein-DNA-complexes. The results indicate a direkt role for the MRN-complex in the G1 phase of the cell cycle. The endonuclease activity of MRN could possibly be involved in resolving the covalently bound protein by endonucleolytic cleavage of the DNA. The resulting free ends are rapidly rejoined by NHEJ. This work allowed insight into the complex network of DSB repair. The contribution of HR to G2 repair was substantiated and identified as the slow component which is responsible for ATM/Artemis dendent repair of a subfraction of DSBs. Repair of these breaks continues using DNA-PK dependent NHEJ in G1 and is channeled into HR in G2. The nature of factors that implicate the dependency on ATM and Artemis merely can be speculated on and require further examination.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology > Zoology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 15 Oct 2009 10:10
Last Modified: 07 Dec 2012 11:55
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-19209
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Identification Number: D17
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Harald, Prof. Dr. Kolmar
Refereed: 15 September 2009
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/1920
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