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Specific targeting of lymphoma cells using semisynthetic anti-idiotype shark antibodies

Macarrón Palacios, Arturo (2021):
Specific targeting of lymphoma cells using semisynthetic anti-idiotype shark antibodies. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00019160,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Specific targeting of lymphoma cells using semisynthetic anti-idiotype shark antibodies
Language: English
Abstract:

The present thesis describes the versatile generation and characterization of anti-idiotype shark-derived vNAR antibodies for the development of personalized lymphoma treatment strategies. This approach relies on the B cell receptor (BCR) as a functionally active and tumor-specific cell surface marker. Since its variable region, referred to as the idiotype (Id), is unique for each B cell clonal population, this molecule differs from BCRs expressed by non-cancerous B lymphocytes but also from BCRs expressed by tumor cells of other patients. Current standard front-line treatment of several non-Hodgkin lymphomas and other hematological malignancies includes a combination of extensive chemotherapy with CD20-targeting monoclonal antibodies. Despite its high efficacy, these therapies involve multiple disadvantages derived from the concomitant depletion of all B lymphocytes of a patient and the resulting profound suppression of the whole immune system. Notwithstanding high initial response rates, most patients eventually relapse and succumb to their disease as a consequence of incomplete depletion of cancerous cells and subsequent treatment regimen resistance. Ever since the first attempts of using anti-idiotype antibodies as targeted therapy for hematological neoplasms over 30 years ago, dramatic technological advances have been made. Promising results have been achieved upon anti-idiotype antibody therapy in vivo, leading even to complete regression of lymphoma patients in clinical studies. Yet, the consequent need of developing a custom-tailored therapy represents a serious technical challenge that impeded the clinical utility of monoclonal anti-idiotypic antibodies as standard of care. Due to the singular attributes of heavy-chain only antibodies from the cartilaginous fish, harnessing these molecules has emerged as an auspicious strategy for the generation of novel therapeutics. During previous work conducted in our research group, various vNAR domains specifically targeting the IgM λ B cell receptor of the human Burkitt lymphoma cell line SUP-B8 were isolated via FACS-based screening of a semi-synthetic, CDR3-randomized yeast surface display vNAR library. After expression of putative lead candidates as vNAR-Fc fusion proteins and its characterization, various strategies were evaluated within the scope of the present thesis for specific killing of malignant B cells. First, we aimed at the stimulation of lymphoma cell apoptosis upon cell surface BCR clustering by means of anti-idiotype vNAR-Fc fusion antibodies. Several antibody formats comprising varying valences, spatial configuration, interdomain spacing, and Fc-related characteristics were designed revealing, however, no antiproliferative effects on cancerous cells. Consequently, we next sought the specific redirection of immune effector cells towards cancer cells. Anti-idiotype bispecific antibodies targeting either FcRI (CD89) expressed by neutrophils and other effector cell populations, or the T cell-related CD3 receptor revealed suitable binding properties and robust T cell activation potential but were finally unable to mediate anti-tumor activity. Monospecific, bivalent vNAR-Fc antibodies also failed at inducing cellular cytotoxicity or phagocytosis via Fc- dependent recruitment of NK cells and macrophages, respectively. As an alternative, we intended the generation of shark-derived antibody-drug conjugates (ADCs). Enzymatic MMAE-conjugation of two vNAR-Fc lead candidates resulted in reproducibly specific lysis of Burkitt cells at picomolar concentrations. Due to the outstanding specificity mediated by the vNAR domains, ADC treatment showed no cytotoxic effects on unrelated CHO cells and on off-target lymphoma cell lines in the same dose range. Hence, this approach offers a wide therapeutic window for personalized lymphoma treatment while preventing overall immunosuppression derived from the ablation of the whole B cell subset in patients. This work demonstrates the feasibility of generating shark-derived immunotherapeutics against lymphoma cells unique to each patient in a cost and time effective manner. Future investigations will evaluate the feasibility of harnessing shark-derived antibodies for the development of further toxin-free personalized therapies.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die vorliegende Arbeit beschreibt die vielseitige Generierung und Charakterisierung von aus dem Hai abgeleiteten anti-idiotypischen vNAR-Antikörpern für die Entwicklung von personalisierten Lymphom-Behandlungsstrategien. Dieser Ansatz stützt sich auf den B Zell-Rezeptor (BCR) als funktionell aktiven und tumorspezifischen Zelloberflächenmarker. Seine variable Region, der so genannte Idiotyp (Id), ist für jede klonale B Zell-Population einzigartig. Somit unterscheidet sich das Molekül von BCRs, die von nicht-krebsartigen B Lymphozyten, aber auch von BCRs, die von Tumorzellen individueller Patienten exprimiert werden. Die derzeitige Standardbehandlung von Non-Hodgkin-Lymphomen und anderen hämatologischen Malignomen beruht auf einer Kombination aus intensiver Chemotherapie und der Gabe von CD20-gerichteten monoklonalen Antikörpern. Trotz ihrer hohen Wirksamkeit sind diese Therapien mit mehreren Nachteilen verbunden, die sich aus der mit der Behandlung einhergehenden Depletion sämtlicher B Lymphozyten eines Patienten und der daraus resultierenden tiefgreifenden Suppression des gesamten Immunsystems ergeben. Trotz hoher anfänglicher Ansprechraten erleiden viele Patienten schließlich einen Rückfall und erliegen ihrer Krankheit aufgrund der unvollständigen Depletion der Krebszellen und folgender Therapieresistenz. Seit den ersten Versuchen, anti-Idiotyp Antikörper als gezielte Therapie für hämatologische Neoplasmen vor über 30 Jahren einzusetzen, wurden signifikante technologische Fortschritte erreicht. Vielversprechende in vivo Ergebnisse wurden mit anti-Idiotyp Antikörper-Therapien erzielt, die in exploratorischen klinischen Studien sogar zur vollständigen Rückbildung von Lymphomen in Patienten führten. Die daraus resultierende Notwendigkeit, eine maßgeschneiderte Therapie zu entwickeln, stellt jedoch eine ernsthafte technische Herausforderung dar, die den klinischen Einsatz von monoklonalen anti-Idiotyp Antikörpern als Standardbehandlung bisher verhindert hat. In Anbetracht der einzigartigen Eigenschaften von schwere-Kette-Antikörpern aus Knorpelfischen hat sich die Nutzung dieser Moleküle als eine vielversprechende Strategie für die Entwicklung neuer Therapeutika herausgestellt. Während früherer Arbeiten in unserer Forschungsgruppe wurden durch FACS-basiertes Screening einer halbsynthetischen, CDR3-randomisierten Hefeoberflächendisplay-vNAR-Bibliothek verschiedene vNAR-Domänen, die spezifisch auf den IgM λ B Zellrezeptor der humanen Burkitt-Lymphom-Zelllinie SUP-B8 abzielen, isoliert. Nach der Expression der mutmaßlichen Leitkandidaten als vNAR-Fc-Fusionsproteine und deren Charakterisierung wurden im Rahmen der vorliegenden Thesis verschiedene Strategien zur spezifischen Abtötung von malignen B Zellen evaluiert. Zunächst zielten wir auf die Apoptose-Stimulierung von Lymphomzellen bei BCR-Clustering auf der Zelloberfläche mittels anti-idiotypischer vNAR-Fc Fusionsantikörper. Es wurden mehrere Antikörperformate mit unterschiedlichen Valenzen, räumlicher Konfiguration, Interdomänenabständen und Fc-bezogenen Eigenschaften entwickelt, die jedoch keine antiproliferativen Effekte auf Krebszellen zeigten. Daher strebten wir anschließend die spezifische Umlenkung von Immuneffektorzellen auf Krebszellen an. Anti-Idiotypische bispezifische Antikörper, die entweder auf FcRI (CD89), welcher von Neutrophilen und anderen Effektorzellpopulationen exprimiert wird, oder auf den T Zell-verwandten CD3-Rezeptor abzielen, zeigten geeignete Bindungseigenschaften und ein robustes T Zell-Aktivierungspotenzial, waren aber letztendlich nicht in der Lage, anti-Tumor-Aktivität zu vermitteln. Monospezifische, bivalente vNAR-Fc-Antikörper versagten ebenfalls bei der Vermittlung von zellulärer Zytotoxizität oder Phagozytose durch Rekrutierung von NK-Zellen bzw. Makrophagen. Als Alternative wurden Antikörper-Toxin-Konjugate generiert (ADCs). Die enzymatische MMAE-Konjugation von zwei vNAR-Fc-Leitkandidaten führte zu einer reproduzierbar spezifischen Lyse von Burkitt-Zellen bei picomolaren Konzentrationen. Aufgrund der herausragenden Spezifität, die durch die vNAR-Domänen vermittelt wird, zeigte die ADC-Behandlung keine zytotoxischen Effekte auf nicht verwandte CHO-Zellen sowie auf off target Lymphom-Zelllinien im gleichen Dosisbereich. Dieser Ansatz bietet somit ein breites therapeutisches Fenster für die personalisierte Lymphom-Behandlung und verhindert gleichzeitig eine allgemeine Immunsuppression, die sich aus der Ablation der gesamten B Zell-Untergruppe bei Patienten ergibt. Diese Arbeit demonstriert die Machbarkeit der Generierung von aus dem Hai gewonnenen Immuntherapeutika gegen patientenspezifische Lymphomzellen auf eine kosten- und zeiteffektive Weise. Zukünftige Untersuchungen werden zeigen, ob aus dem Hai abgeleitete anti-Idiotyp Antikörper für die Entwicklung weiterer personalisierter Therapien zu Einsatz kommen können.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: vi, 122 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 28 Oct 2021 12:20
Last Modified: 28 Oct 2021 12:21
DOI: 10.26083/tuprints-00019160
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-191601
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Ullrich, Prof. Dr. Evelyn ; Neumann, Prof. Dr. Siegfried ; Löwer, Prof. Dr. Alexander
Refereed: 11 October 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19160
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