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Mutationen in GvpA und GvpJ - Eine Mutationsanalyse zweier essentieller Gasvesikelproteine

Knitsch, Regine (2021):
Mutationen in GvpA und GvpJ - Eine Mutationsanalyse zweier essentieller Gasvesikelproteine. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00018607,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation RegineKnitsch__TUprints_20.05.2021.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Mutationen in GvpA und GvpJ - Eine Mutationsanalyse zweier essentieller Gasvesikelproteine
Language: German
Abstract:

Um in hypersalinen Lebensräumen ihren Nährstoff- und Sauerstoffbedarf decken zu können sowie um in Bereiche mit hoher Lichtintensität zu gelangen, können viele Bakterien und Archaea, unter anderem Halobacterium salinarum, Gasvesikel bilden. Diese gasgefüllten, intrazellulären Nanostrukturen sind ausschließlich aus Protein aufgebaut und ermöglichen den Organismen eine passive Flotation an die Gewässeroberfläche. Das essentielle Protein GvpA (8 kDa) ist hierbei das Hauptstrukturprotein. Bis dato konnte noch keine Kristallstruktur von GvpA generiert werden, jedoch weist dessen Sekundärstruktur auf eine coil-α-β-β-α-coil Struktur hin, die durch solid-state NMR Analysen unterstützt wird. Mittels high-performance de novo Modellierung wurde zudem eine hypothetische 3D-Struktur erstellt. Auch GvpJ (12 kDa) gehört zu den essentiellen Gasvesikelproteinen, jedoch ist dessen Funktion bislang noch unbekannt. Die Aminosäuresequenz von GvpJ ähnelt zu 50% der von GvpA und auch hier deutet die Sekundärstruktur auf α-Helices und β-Faltblätter, ähnlich dem GvpA-Protein, hin. Um die Bedeutung einzelner Aminosäuren für die Gasvesikelbildung zu testen, wurden verschiedene Proteinmutanten hergestellt (GvpAMut und GvpJMut) und ihre Auswirkungen auf die Gasvesikelbildung in ∆A+AMut bzw. ∆J+JMut-Transformanten untersucht. Neben deren Einfluss auf die Gasvesikelbildung wurde auch ihr Einfluss auf die Gasvesikel-Morphologie analysiert. Hierbei wurden in dieser Arbeit zweiundsechzig Einzel- sowie zwei doppelte Aminosäuresubstitutionen innerhalb von GvpA und dreißig Aminosäuresubstitutionen in GvpJ analysiert. In GvpA führen die meisten Substitutionen innerhalb der ersten α-Helix zu Vac-negativen Transformanten. Besonders fällt auf, dass die Substitution aller geladener Aminosäuren zu Vac-negativen Transformanten führt. Nach dem hypothetischen Strukturmodell befinden sich diese auf der äußeren Oberfläche von GvpA und bilden dort vermutlich Salzbrücken mit anderen GvpA-Monomeren benachbarter Rippen. Eine Besonderheit ist hierbei R15, dessen Substitution generell zu Vac-negativen Transformanten führt und somit eine essentielle Aminosäure darstellt. Innerhalb der β-Faltblätter führt dagegen eine Alanin-Substitution der alternierenden, hydrophoben Aminosäuren zu Vac-positiven Zellen. Substituiert man diese jedoch durch geladene oder aromatische Aminosäuren (= hydrophile AS), führt dies zu Vac-negativen Zellen. Dies deutet darauf hin, dass weitere Ladungen die hydrophobe Innenoberfläche zerstören was mit einem Funktionsverlust des Gasvesikels einhergeht. Im Gegensatz dazu haben Substitutionen innerhalb der zweiten α-Helix kaum einen Effekt auf die Gasvesikelbildung, eher auf deren Morphologie. Über die hypothetischen Strukturabschnitte von GvpJ können dagegen keine solch übergreifenden Aussagen gemacht werden. Von den dreißig in dieser Arbeit eingeführten Substitutionen bilden nur acht Transformanten Gasvesikel, die meist wildtypähnlich sind. Nur ∆J+JE69A bildet zylindrische Gasvesikel und ∆J+JV25A und ∆J+JS34A besitzen instabile Gasvesikel. Alle restlichen Transformanten sind Vac-negativ. Vermutlich erzeugen die Substitutionen Konformationsänderung in GvpJ oder erschweren bzw. unterbinden sogar die Bindung zu anderen akzessorischen Gvp-Proteinen. GvpJ könnte daher in frühen Stadien der Gasvesikelbildung benötigt werden, wo es vermutlich Bestandteil eines initialen Proteinkomplexes ist.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

To cover up their requirements of nutrients, oxygen and light in hyper saline habitats, a wide range of bacteria and archaea – like Halobacterium salinarum – are able to produce gas vesicles. These gas-filled, proteinaceous nanostructures support the flotation of the organisms to the surface of their watery environment. The essential protein GvpA (8 kDa) is the main structural protein. A crystal structure is not available to date, but its secondary structure implies a coil-α-β-β-α-coil. A hypothetical 3D-model was constructed by high-performance de novo modelling. GvpJ (12 kDa) is also an essential gas vesicle protein but its function is still unknown. The amino acid (aa) sequence of GvpJ is similar to the aa sequence of GvpA (50%) and its secondary structure implies also α-helices and β-sheets. To test the importance of single aa on gas vesicle formation, several protein mutants were constructed (GvpAMut und GvpJMut) and analysed on their ability to form gas vesicles in ∆A+AMut and ∆J+JMut transformants, respectively. The influence of the mutations on their ability to form gas vesicles was also analysed as well as the influence on gas vesicle morphology. In this respect, 62 single aa substitutions and 2 double aa substitutions in GvpA were analysed in addition to 30 aa substitutions in GvpJ. Most aa substitutions in α-helix 1 of GvpA resulted in Vac-negative transformants, especially substitutions of the charged aa. According to the hypothetical 3D-model of GvpA the charged aa are located at the exterior surface of the protein and presumably form salt-bridges with another GvpA monomer in an adjacent rib. R15 is an essential aa, because substitutions by several aa lead to Vac-negative transformants. An Alanin substitution of the hydrophobic, alternating aa in both β-sheets resulted in Vac-positive transformants, whereas a substitution by charged or aromatic aa resulted in Vac-negative transformants indicating that additional charges destroy the hydrophobic interior surface of the gas vesicle wall. Substitutions in α-helix 2 are less important for gas vesicle formation rather on the morphology. Such statements are not feasible regarding the hypothetical structure of GvpJ. Just 8 of the 30 aa substitutions in GvpJ resulted in Vac-positive transformants, most of them similar to the wild type. The transformants of ∆J+JE69A produced cylindrical gas vesicles whereas ∆J+JV25A and ∆J+JS34A produced instable gas vesicles. All other ∆J+JMut transformants resulted in Vac-negative cells. Probably the aa substitutions generate alterations in the protein structure or prohibit an interaction with other accessory Gvp proteins. That’s why GvpJ is perhaps required in the early stages of gas vesicle formation, were it is probably part of an initial protein complex.

English
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 80 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Microbiology and Archaea
Date Deposited: 28 May 2021 11:11
Last Modified: 28 May 2021 11:11
DOI: 10.26083/tuprints-00018607
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-186078
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kletzin, PD Dr. Arnulf
Refereed: 20 April 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/18607
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