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Analysis of M4 transmembrane domains in NMDA receptor function: a negative allosteric modulator site at the GluN1-M4 is determining the efficiency of neurosteroid modulation

Langer, Kai (2021):
Analysis of M4 transmembrane domains in NMDA receptor function: a negative allosteric modulator site at the GluN1-M4 is determining the efficiency of neurosteroid modulation. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00018595,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Analysis of M4 transmembrane domains in NMDA receptor function: a negative allosteric modulator site at the GluN1-M4 is determining the efficiency of neurosteroid modulation
Language: English
Abstract:

Ionotropic glutamate receptors (iGluRs), like the NMDA receptor, are ligand-gated ion channels. These receptors make up an important part of the mammalian central nervous system (CNS) as they allow rapid excitatory signal transduction. NMDA receptors are built of four structurally identical subunits. Of the structurally identical subunits, three main types exist (GluN1, GluN2, GluN3), which are freely combined, with GluN1 always being incorporated twice. The transmembrane regions of these subunits consist of four alpha-helices named M1 – M4 domains. M1, M2 and M3 of all GluN subunits were identified to form the ion channel pore. Ligand binding at NMDA receptors leads to an opening of this pore which allows an ion flow across a membrane. The role of the M4 domain within the NMDA receptor is not yet clearly defined and was therefore investigated in this thesis. Herein approaches of M4-truncations, M4 segment coexpression and introduction of point mutations into the M4 domain were used to get an insight into the role of the M4 domain in functionality, assembly, and steroid modulation of NMDA receptors. It could be shown that the M4 domains of GluN1/GluN2A and GluN1/GluN3A NMDA receptors are not involved in receptor assembly nor in surface trafficking. However, M4-truncation lead to an impeded functionality of the analyzed ion channels that could be rescued by coexpression of the respective M4 segment indicating its importance in NMDA receptor function. Introduction of point mutations identified two residues in the upper part of the GluN1-M4 domain to be necessary for this rescue effect. These residues form interaction points of the GluN1-M4 domain with M1 or M3 domains of neighboring GluN2 subunits. The upper part of the M4 was thought to affect the modulation of NMDA receptors by neurosteroids like Pregnenolone sulfate (PS) and an involvement of this M4 part in neurosteroid modulation could be verified in this work. Furthermore, two further residues in GluN1-M4 were found to influence the affinity of PS to and the effect of PS on GluN1/GluN2 and GluN1/GluN3 receptors indicating these residues to build a negative allosteric modulation site for PS. All in all, this thesis gives new insights into the function of the M4 domain within GluN1/GluN2 and GluN1/GluN3 receptors highlighting the role in regulating receptor function. Furthermore, the herein obtained data allow a better understanding of NMDA receptor modulation by compounds with PS-like properties and therefore form a basis for further research investigating therapeutic strategies for selective NMDA receptor modulation.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs), wie der NMDA-Rezeptor, sind Liganden-gesteuerte Ionenkanäle. Diese Rezeptoren bilden einen wichtigen Teil des zentralen Nervensystems (ZNS) von Säugetieren, da sie eine schnelle exzitatorische Signaltransduktion ermöglichen. NMDA-Rezeptoren bestehen aus vier strukturell identischen Untereinheiten. Von diesen strukturell identischen Untereinheiten existieren drei Haupttypen (GluN1, GluN2, GluN3), die frei kombiniert werden, wobei GluN1 immer zweimal eingebaut wird. Die Transmembranregion dieser Untereinheiten bestehen aus vier Alpha-Helices, die als M1 – M4 Domänen bezeichnet werden. M1, M2 und M3 aller GluN-Untereinheiten bilden die Ionenkanalpore aus. Ligandenbindung an NMDA-Rezeptoren führt zu einer Öffnung dieser Pore, die einen Ionenfluss durch die Membran ermöglicht. Die Rolle der M4-Domäne innerhalb des NMDA-Rezeptors ist nicht vollständig geklärt und wurde daher im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Es wurden M4-Trunkierungen, M4 Segment Koexpressionen und M4-Domänen mit Punktmutationen analysiert, um Einblicke in die Rolle der M4-Domäne in der Funktionalität, Assemblierung und Steroidmodulation von NMDA-Rezeptoren zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass die M4-Domänen von GluN1/GluN2A- und GluN1/GluN3A-Rezeptoren weder an der Rezeptor-Assemblierung noch am Oberflächen-Transport beteiligt sind. M4-Trunkierungen führten zu einem Funktionsverlust der Ionenkanäle, der durch Koexpression des entsprechenden M4 Segments wiederhergestellt werden konnte, was die Bedeutung der M4 für die NMDA Rezeptor Funktion hervorhebt. Durch Einführung von Punktmutationen wurden zwei Aminosäuren im oberen Teil der GluN1-M4-Domäne identifiziert, welche für die Wiederherstellung der Funktion durch M4 Koexpression ausschlaggebend sind. Diese Aminosäuren bilden Interaktionspunkte der GluN1-M4 mit den M1- oder M3-Domänen der benachbarten GluN2-Untereinheit. Des Weiteren wurde vermutet, dass der obere Teil der M4-Domäne die Modulation von NMDA-Rezeptoren durch Neurosteroide wie Pregnenolonsulfat (PS) beeinflusst. Diese Beteiligung der M4-Region an der Modulation durch Neurosteroide konnte in dieser Arbeit gezeigt werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass zwei Aminosäure-Positionen in der GluN1-M4 die Affinität von PS zu und die Wirkung von PS auf GluN1/GluN2- und GluN1/GluN3-Rezeptoren beeinflussen, was darauf hinweist, dass diese Positionen eine negative allosterische Modulationsstelle für PS bilden. Zusammengefasst gibt diese Arbeit neue Einblicke in die Funktion der M4-Domäne innerhalb von GluN1/GluN2- und GluN1/GluN3-Rezeptoren und hebt deren Rolle in der Regulierung der Rezeptorfunktion hervor. Darüber hinaus liefert sie ein besseres Verständnis der Modulation von NMDA-Rezeptoren durch Substanzen mit PS-ähnlichen Eigenschaften und bildet damit eine Grundlage für weitere Forschung hinsichtlich therapeutischer Strategien zur selektiven Modulation von NMDA-Rezeptoren.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 64 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Neurophysiology and Neurosensory Systems
Date Deposited: 28 May 2021 11:05
Last Modified: 28 May 2021 11:06
DOI: 10.26083/tuprints-00018595
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-185950
Referees: Laube, Prof. Dr. Bodo ; Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 11 May 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/18595
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