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Factors regulating late stages of homologous recombination and sub-pathway choice in G2

Elbakry, Amira (2021):
Factors regulating late stages of homologous recombination and sub-pathway choice in G2. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
DOI: 10.26083/tuprints-00017575,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Factors regulating late stages of homologous recombination and sub-pathway choice in G2
Language: English
Abstract:

Cells have evolved multiple mechanisms to preserve genome integrity and restore structural and functional properties of the genome following deoxyribonucleic acid (DNA) damage. DNA double-strand breaks (DSBs) are critical lesions whose timely and faithful repair is important for cellular viability and genomic stability. Among the multiple pathways dedicated for handling DSBs, homologous recombination (HR) provides a high-fidelity mechanism for error-free repair in cycling cells. HR is also important for the faithful duplication of the genome by providing means of tolerating replication stress and overcoming a variety of lesions occurring as a result of replication errors such as single-strand breaks, gaps and one-ended DSBs that impede progressing replication forks. HR at two-ended DSBs can proceed through two known sub-pathways with distinct genetic outcomes: the double Holliday junction (dHJ) pathway and synthesis-dependent strand annealing (SDSA), which result in crossover (CO) and non-CO recombination products, respectively. Although the initial steps of HR, such as resection, have been extensively studied, less is known about late stages of HR, especially in mammalian cell, as well as the factors governing sub-pathway choice. Here, experiments were set up to specifically analyse HR-mediated repair of X-ray-induced DSBs in G2 cells, a setup that avoids the complications of S-phase induced damage and focuses on two-ended breaks. The first part of this study shows that the histone variant H3.3 is required during late stages of HR, in a step following Rad51 loading and removal, and in a manner epistatic to the chromatin remodeler ATRX. Indeed, H3.3 is needed for DNA repair synthesis in G2 cells, and subsequent formation of sister chromatid exchanges (SCEs). To monitor in vivo histone deposition, a stable cell line system expressing SNAP-H3.3 was used to visualize newly synthesized histone incorporation following laser-induced DNA damage. Consistent with previous reports, H3.3 is deposited early (up to 1 h) post IR, but through an HR-independent mechanism. However, late H3.3 incorporation (8 h) was dependent on Rad51, ATRX and the chaperon DAXX, corroborating an active deposition of H3.3 at sites of DNA damage during HR. Furthermore, H3.3 deposition was also dependent on the processivity factor PCNA and its loader RFC-1, suggesting a tight association with DNA synthesis. The results collectively inspire a model where ATRX-DAXX-mediated H3.3 deposition is tightly coupled to DNA repair synthesis and serves to facilitate progression of the displacement loop (D-loop) and repair completion in a sub-pathway of HR that leads to the formation of CO products. Page | 2 To further understand the regulation of HR sub-pathway choice, cells lacking ATRX and the SDSA factor RECQ5 were analysed for their HR repair capacity. ATRX-deficient U2OS cells with inducible ATRX expression and HeLa cells were used to establish comparisons of pathways usage. While both cell lines are dependent on Rad51 for repair of G2-induced DSBs, ATRX-deficient cells rely entirely on RECQ5-mediated SDSA for the repair of these breaks, while HeLa cells can employ both pathways. Further analysis revealed that ATRX-dependent HR dominates in cells that have both factors, resulting in elevated IR-induced SCEs in cells with induced ATRX expression. Additional factors were analysed to show that SDSA surprisingly does not require the essential HR factor Rad54 for repair, indicating the deeper inherent differences between these two sub-pathways and suggesting a more complex regulation of pathway choice. Quantitative analysis of HR events showed that approximately 50% of ATRX-dependent HR events result in a CO product, a much higher frequency than previously thought. This led to further analysis of HR intermediates formed in this pathway manifesting as IR-induced ultra-fine bridges (UFBs) visualized in anaphase cells lacking the resolvases Mus81 and Gen. IR-induced UFBs formed in an ATRX-dependent manner, suggesting that these HR intermediates are largely processed by the resolution pathway. Furthermore, Mus81 foci analysis showed that Mus81 was recruited to DSBs in mitotic HeLa cells but not in U2OS cells, suggesting the presence of distinct HR intermediates in these cells. Recruitment of Mus81 was not affected by BLM depletion, suggesting that Mus81 is occupying all suitable substrates even in the presence of BLM and that these structures are not subject to dissolution. Similarly, BLM depletion did not affect Rad51 foci formation, γH2AX foci dynamics, or the level of IR-induced SCEs, further corroborating the notion that BLM is not active in this sub-pathway of HR. Taken together, the data suggest that ATRX-dependent HR dominates over RECQ5-dependent SDSA for the repair of two-ended breaks in G2 cells. This pathway involves the formation of HR intermediates that are exclusively resolved by the structure-specific nucleases Mus81 and Gen1 while being refractory to dissolution, explaining the observed high frequency of SCEs observed. This dominance could be explained by a model whereby ATRX-dependent histone deposition inside an expanding D-loop structurally hinders both strands displacement during SDSA and the dissolution of a dHJ by BLM.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Zur Erhaltung der Integrität des Genoms haben Zellen vielfältige Mechanismen entwickelt, um die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Genoms nach einem DNA-Schaden wiederherzustellen. Eine schnelle und fehlerfreie Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) ist essenziell für die genomische Stabilität und das Überleben der Zellen. Die homologe Rekombination (HR) ist ein fehlerfreier DSB-Reparaturmechanismus, der proliferierenden Zellen zur Verfügung steht. HR ist außerdem an der fehlerfreien Duplikation des Genoms beteiligt, indem es dazu beiträgt Replikationsstress zu tolerieren und Schäden, die die Replikationsgabel blockieren zu prozessieren (Einzelstrangbrüche, gaps oder einendige DSBs). An zweiendigen DSBs können zwei Unterwege der HR ablaufen, die unterschiedliche genetische Endprodukte haben: der double Holliday junction (dHJ) pathway, wodurch crossover (CO) Produkte entstehen und synthesis dependent strand annealing (SDSA) wodurch non-CO Produkte entstehen. Wobei über die ersten Schritte der HR, wie z.B. die Resektion, sehr viel bekannt ist, ist über die späteren HR-Schritte und die Faktoren, die an der Wahl des Unterwegs beteiligt sind, vor allem in Säugerzellen nur wenig bekannt. In dieser Studie wurde die HR-Reparatur von Röntgenstrahl (IR)-induzierten DSBs in der G2 Phase untersucht. Durch die spezifische Analyse von G2-Phase Brüchen konnten S-Phase Brüche ausgeschlossen werden und somit die Analyse auf 2-endige DSBs fokussiert werden. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Histon-Variante H3.3 nach der Entfernung von Rad51 und somit in einem späten Stadium der HR erforderlich ist. Außerdem konnte gezeigt werden, dass H3.3 epistatisch mit dem Chromatin-remodeler ATRX wirkt. H3.3 wird für die Reparatursynthese und die darauffolgende Ausbildung von Schwesterchromatidaustauschen (SCEs) in G2 Zellen benötigt. Um den Chromatineinbau von H3.3 in vivo zu messen wurde eine stabile Zelllinie hergestellt, die SNAP-H3.3 exprimiert. Mithilfe dieser Zelllinie konnte der Einbau von neu synthetisierten H3.3 Histonen an Laser-induzierten DNA-Schäden visualisiert werden. H3.3 wird zu frühen Zeitpunkten (bis 1 h) post IR mithilfe eines HR-unabhängigen Mechanismus in das Chromatin eingebaut. Zu späteren Zeitpunkten (8 h) post IR wird H3.3 aktiv am DNA-Schaden durch HR in das Chromatin eingebaut und ist daher abhängig von Rad51, ATRX und DAXX. Des Weiteren ist der aktive Einbau von H3.3 abhängig von PCNA und RCF-1, was eine direkte Verbindung mit der DNA-Synthese nahelegt. Diese Ergebnisse legen ein Modell nahe, bei dem der Einbau von H3.3 in das Chromatin durch ATRX und DAXX vermittelt wird und eng an die DNA-Reparatursynthese gekoppelt ist. Dabei wird die Progression des D-Loops unterstützt und CO Produkte entstehen. Page | 4 Um die Regulierung der Wahl des HR Unterwegs besser zu verstehen wurde die HR-Reparaturkapazität von ATRX- und RECQ5-defizienten Zellen untersucht. Für den direkten Vergleich der beiden Unterwege wurden U2OS Zellen mit induzierbarer ATRX-Expression und HeLa Zellen verwendet. Während beide Zelllinien für die Reparatur von G2-induzierten DSBs Rad51 benötigen, können ATRX-defiziente Zellen ihre DSBs ausschließlich mit Hilfe des RECQ5-abhängigen SDSA reparieren, während HeLa Zellen von beiden Unterwegen Gebrauch machen können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Zellen denen beide Unterwege zur Verfügung stehen, ATRX-abhängiges HR bevorzugt verwenden. Dies führt zu erhöhten IR-induzierten SCEs in Zellen mit induzierter ATRX Expression. Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass der essenzielle HR-Faktor Rad54 für die Reparatur mittels SDSA nicht benötigt wird, was auf die tieferen inhärenten Unterschiede zwischen diesen beiden Unterwegen hinweist und eine komplexere Regulierung der Wegwahl nahelegt. Die quantitative Analyse von HR-Ereignissen zeigte, dass etwa 50% der ATRX-abhängigen HR-Ereignisse zu einem CO-Produkt führen, eine viel höhere Frequenz als bisher angenommen. Die weiterführende Analyse der ausgebildeten HR-Strukturen zeigte, dass IR-induzierte ultrafeine Brücken (UFBs) in Anaphasezellen sichtbar werden. Die Anzahl der UFBs, die nach IR gebildet werden, ist signifikant höher in Zellen ohne die Resolvasen Mus81 und Gen1. Dies zeigt, dass HR-Strukturen weitgehend durch resolution aufgelöst werden. Darüber hinaus zeigte die Analyse der Mus81-Foci, dass Mus81 zu DSBs in mitotischen HeLa-Zellen rekrutiert wird, jedoch nicht in U2OS-Zellen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass unterschiedliche HR-Intermediatstrukturen in diesen Zellen vorliegen. Die Rekrutierung von Mus81 wurde durch eine BLM-Depletion nicht beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass Mus81 alle geeigneten Substrate in Anwesenheit von BLM besetzt und dass diese Strukturen nicht durch dissolution aufgelöst werden. Des Weiteren hatte eine BLM-Depletion keinen Effekt auf Rad51-Foci, γH2AX-Foci oder die Anzahl der IR-induzierten SCEs, was die Vermutung, dass die BLM in diesem HR-Unterweg nicht aktiv ist, weiter bestätigt. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass ATRX-abhängiges HR gegenüber dem RECQ5-abhängigen SDSA bei der Reparatur von zweiendigen DSBs in G2-Zellen überwiegt. Bei diesem Reparaturweg werden HR-Intermediate ausgebildet, die ausschließlich von den strukturspezifischen Nukleasen Mus81 und Gen1 aufgelöst werden, und somit nicht durch dissolution aufgelöst werden können, was die erhöhte Anzahl von SCEs erklärt. Dies legt ein Modell nahe, bei dem die ATRX-abhängige Histonablagerung innerhalb des D-loops die Verdrängung des DNA Strangs während SDSA und die dissolution einer dHJ durch BLM strukturell behindert.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VII, 112 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
Date Deposited: 19 Mar 2021 14:20
Last Modified: 19 Mar 2021 14:20
DOI: 10.26083/tuprints-00017575
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-175757
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Löwer, Prof. Dr. Alexander
Refereed: 5 June 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/17575
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