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Goldnanopartikel-basierte Aptasensoren zum Nachweis von Antibiotika

Schneider, Jeannine (2021):
Goldnanopartikel-basierte Aptasensoren zum Nachweis von Antibiotika. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00017509,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation Jeannine Schneider.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Goldnanopartikel-basierte Aptasensoren zum Nachweis von Antibiotika
Language: German
Abstract:

RNA-Aptamere sind kurze, einzelsträngige Nukleinsäuren, die über in vitro Selektionen (SELEX-Methode) gewonnen werden und einen Liganden hochaffin und spezifisch binden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Aptamere für den Aufbau von Nachweissystemen genutzt, um die Anwesenheit von unterschiedlichen Antibiotika zu detektieren. Sowohl Antibiotikarückstände in Nahrungsmitteln und Trinkwasser als auch Antibiotikafälschungen stellen eine immer größer werdende Belastung der Bevölkerung dar. Der Nachweis dieser ist folglich von großer Dringlichkeit und sollte zudem schnell, effizient und kostengünstig erfolgen. Deshalb wurden für den Aufbau der Nachweissysteme sowohl das Ciprofloxacin- als auch das Tobramycin-Aptamer verwendet. Beide Aptamere lagen zu Beginn dieser Arbeit charakterisiert vor. Die Dissoziationskonstanten, welche im niedrigen nanomolaren Bereich liegen, ermöglichen den späteren Nachweis von Antibiotikarückständen in Lebensmitteln, da die maximal erlaubten Rückstandsmengen sich oberhalb dieser Konstante bewegen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein druckbares Nachweissystem für Ciprofloxacin in Zusammenarbeit mit dem Druckinstitut für Druckmaschinen und Druckverfahren der TU Darmstadt entwickelt. Durch die Analyse verschiedenster Trägermaterialien und erster Untersuchungen zur Stabilität von Nukleinsäuren nach dem Druck konnte ein Papier-basierter Teststreifen entwickelt werden, welcher gedruckte und getrocknete Aptamere für den Nachweis von Ciprofloxacin enthielt. Der Nachweis des Liganden erfolgte dabei über die Eigenfluoreszenz von Ciprofloxacin. Es konnte gezeigt werden, dass RNA-Aptamere für längere Zeit auf Papier-basiertem Trägermaterial gelagert werden können und anschließend weiterhin Funktion zeigen. Die Nachweisgrenze kann dabei individuell festgelegt werden, solange das Aptamer in äquimolarem Verhältnis zum nachzuweisenden Ciprofloxacin eingesetzt wird. Ein Nachteil dieser Art von Nachweissystemen ist jedoch, dass sie auf eine Auswertung im Labor angewiesen sind und somit die Hilfe von technischen Geräten benötigen. Aus diesem Grund wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein Nachweissystem auf Basis von Goldnanopartikeln entwickelt. Diese Partikel besitzen die Eigenschaft, in dispergiertem Zustand rot und in aggregiertem Zustand blau zu erscheinen. Dieser Farbumschlag ist mit dem bloßen Auge erkennbar, weshalb die anschließenden Tests direkt im freien Feld einsetzbar wären und nicht auf die Zuhilfenahme von technischen Geräten angewiesen sind. Es folgte die ausgiebige Charakterisierung unterschiedlicher Goldnanopartikel und die Untersuchung von Einflüssen wie Temperatur und pH-Wert auf die Partikelstabilität. Mit den so gewonnenen Ergebnissen wurde ein erstes, kolorimetrisches Nachweissystem entwickelt, bei dem die Ciprofloxacin-Aptamere unspezifisch auf der Partikeloberfläche gebunden vorlagen. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass die Zugabe des Liganden zu keiner Farbänderung der Partikel führte, weshalb der Sensor als nicht funktionsfähig eingestuft wurde. Die Methode der Capture-SELEX ist eine Variation der klassischen SELEX, bei der jedes Aptamer eine kurze definierte Sequenz enthält, über die das Aptamer an ein sogenanntes Capture-Oligonukleotid gekoppelt werden kann. Die Zugabe des Liganden während der SELEX führt anschließend wieder zur Ablösung der Aptamere vom Capture-Oligonukleotid und zur Selektion dieser. Die Einbindung dieses Capture-Oligonukleotids in die Entwicklung eines Nachweissystems ermöglicht folglich ein modulares Nachweissystem für alle aus der Capture-SELEX hervorgegangenen Aptamere. In Kombination mit Goldnanopartikel würde zudem ein modulares Nachweissystem mit sichtbarem Farbumschlag ermöglicht werden. Mit Hilfe von verschiedenen Kopplungsmethoden konnte im Rahmen dieser Arbeit das Capture-Oligonukleotide auf der Partikeloberfläche von Goldnanopartikeln kovalent immobilisiert werden. Die anschließende Bindung des Tobramycin-Aptamers an die Capture-Oligonukleotide auf der Partikeloberfläche führte zu einer Art Schutzhülle um die Partikel, welche eine frühzeitige Aggregation verhinderte (rote Färbung der Partikel). Die Zugabe des Liganden Tobramycin führte anschließend zum Ablösen der Aptamere von den Capture-Oligonukleotiden, was einen Farbumschlag der Partikel von rot nach blau zur Folge hatte, der die Anwesenheit des Liganden signalisierte. Die Entwicklung eines ersten Prototyps zum Nachweis von Tobramycin war erfolgreich. In weiteren Versuchen muss die Übertragbarkeit auf andere Capture-SELEX-Aptamere geprüft und Experimente zur Verbesserung der Sensitivität durchgeführt werden. Die hohe Modularität des Systems sowie dessen einfache Handhabung machen dieses nun zu einem idealen Kandidaten für Goldnanopartikel-basierte Aptasensoren für den Nachweis von Antibiotikarückständen oder Antibiotikafälschungen. Eine Analyse der Marktfähigkeit solcher Nachweissysteme erfolgte parallel zu den Arbeiten im Labor durch eine Umfrage der Bevölkerung, an der 500 Probanden teilnahmen. Die Ergebnisse legten offen, dass der Großteil der Befragten bereits von Antibiotikarückständen in Lebensmitteln gehört hatte, jedoch nicht alle aufgrund dessen besorgt seien. Es zeigte sich jedoch, dass Schnelltests für den Nachweis solcher Rückstände eine potenzielle Marktlücke darstellen, da die Mehrheit der Befragten von diesen Gebrauch machen würde.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
RNA aptamers are short, single-stranded nucleic acids that are generated by in vitro selections (SELEX method) and bind a ligand with high affinity and specificity. In the context of this work aptamers were used for the construction of detection systems to detect the presence of different antibiotics. Antibiotic residues in food and drinking water as well as antibiotic counterfeits represent an increasing problem for the population. The detection of these is therefore a matter of great urgency and should also be carried out quickly, efficiently and cost-effectively. For this reason, both the ciprofloxacin and the tobramycin aptamer were used to set up the detection systems. Both aptamers were characterized at the beginning of this work. The dissociation constants, which are in the low nanomolar range, allow the subsequent detection of antibiotic residues in food, since the maximum residue limits are above this constant. In the first part of this work, a printable detection system for ciprofloxacin was developed in cooperation with the Printing Institute for Printing Science and Technology at the TU Darmstadt. By analyzing a wide variety of carrier materials and initial investigations into the stability of nucleic acids after printing, a paper-based test strip was developed which contained printed and dried aptamers for the detection of ciprofloxacin. The detection of the ligand was carried out by the intrinsic fluorescence of ciprofloxacin. It could be shown that RNA aptamers can be stored for a longer period of time on paper-based substrates and continue to function afterwards. The detection limit can be individually determined as long as the aptamer is used in equimolar ratio to the ciprofloxacin to be detected. A disadvantage of this type of detection system, however, is that it is dependent on evaluation in the laboratory and thus requires the assistance of technical equipment. For this reason, a detection system based on gold nanoparticles was developed in the second part of this work. These particles have the property to appear red in dispersed state and blue in aggregated state. This color change is visible to the naked eye, which is why the subsequent tests could be performed directly in the open field and do not require the use of technical equipment. This was followed by the extensive characterization of different gold nanoparticles and the investigation of influences such as temperature and pH value on particle stability. With the results obtained in this way, a first colorimetric detection system was developed, in which the ciprofloxacin aptamers were non-specifically bound on the particle surface. However, the results showed that the addition of the ligand did not lead to a change in particle color, which is why the sensor was classified as non-functional. The Capture-SELEX method is a variation of the classical SELEX, in which each aptamer contains a short defined sequence by which the aptamer can be coupled to a so-called capture oligonucleotide. The addition of the ligand during the SELEX subsequently leads to the separation of the aptamers from the capture oligonucleotide and to the selection of these aptamers. The integration of this capture oligonucleotide in the development of a detection system thus enables a modular detection system for all aptamers resulting from the capture SELEX. In combination with gold nanoparticles, a modular detection system with visible color change would also be possible. Using different coupling methods, the capture oligonucleotide could be covalently immobilized on the particle surface of gold nanoparticles. The subsequent binding of the tobramycin aptamer to the capture oligonucleotides on the particle surface led to a kind of protective envelope around the particles, which prevented early aggregation (red coloration of the particles). The addition of the ligand tobramycin subsequently led to the detachment of the aptamers from the capture oligonucleotides, which resulted in a color change of the particles from red to blue, signaling the presence of the ligand. The development of a first prototype for the detection of tobramycin was successful. In further experiments the transferability to other capture-SELEX-aptamers has to be tested and experiments to improve the sensitivity have to be performed. The high modularity of the system and its ease of use now make it an ideal candidate for gold nanoparticle-based aptasensors for the detection of antibiotic residues or antibiotic counterfeits. An analysis of the marketability of such detection systems was carried out in parallel to the work in the laboratory by means of a survey of the population, in which 500 test persons participated. The results revealed that the majority of respondents had already heard about antibiotic residues in food, but not everyone was concerned about it. However, it was found that rapid tests for the detection of such residues were a potential market gap, as the majority of respondents would use them.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
10 Department of Biology > RNA Biochemistry
Date Deposited: 28 Jan 2021 08:38
Last Modified: 28 Jan 2021 08:39
DOI: 10.26083/tuprints-00017509
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-175095
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Kabisch, Prof. Dr. Johannes
Refereed: 17 December 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/17509
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