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Kurz- und langfristige Auswirkungen strahleninduzierter DNS Doppelstrangbrüche auf das neuronale Netzwerk am in vitro und in vivo Mausmodell

Häupl, Katja (2020):
Kurz- und langfristige Auswirkungen strahleninduzierter DNS Doppelstrangbrüche auf das neuronale Netzwerk am in vitro und in vivo Mausmodell. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00015393,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Kurz- und langfristige Auswirkungen strahleninduzierter DNS Doppelstrangbrüche auf das neuronale Netzwerk am in vitro und in vivo Mausmodell
Language: German
Abstract:

Niedrigdosierte Röntgenstrahlung kommt heutzutage überwiegend in der medizinischen Bildgebung zum Einsatz und spielt dabei eine entscheidende Rolle in der Diagnostik. Besonders an Kleinkindern werden computertomographische Untersuchungen mit niedrigdosierter Röntgenstrahlung durchgeführt. Dabei ist der Kopf das am häufigsten untersuchte Körperteil. Neben der Verwendung in der medizinischen Diagnostik wird Röntgenstrahlung auch als Therapiemittel gegen Tumore eingesetzt. Zusätzlich werden Menschen bei Flug- und Weltraumreisen durch natürliche Strahlung belastet. Umso wichtiger ist die Untersuchung der Strahlungseffekte auf den Organismus. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Analyse von Strahlungseffekten auf das neuronale Netzwerk. Ein direkter und zugleich folgenreicher Schaden der Röntgenstrahlung ist die Induktion von DNS-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Proliferierende Zellen, zu denen unter anderem Stammzellen gehören, besitzen prinzipiell zwei Reparaturwege um DNS DSBs zu reparieren: die homologe Rekombination (HR) und die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ). Ausdifferenzierte Zellen wie Neurone und Gliazellen können nur noch auf den häufig fehlerhaften NHEJ-Reparaturweg zurückgreifen. Nicht oder fehlerhaft reparierte DNS DSBs führen zu Seneszenz, Apoptose oder Zellentartung und können auf diese Weise die Pathogenese von Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Krebs fördern. Um den Einfluss einer nicht funktionalen HR auf die Radiosensitivität im sich entwickelnden neuronalen Netzwerk zu untersuchen, wurde das HR-defiziente Rad54-/- Mausmodell gewählt. Die Versuchstiere wurden während den neurologisch störungssensiblen Phasen E14.5 und p10 mit 500 mGy bestrahlt und im adulten Stadium hinsichtlich ihrer motorischen Fähigkeiten sowie ihres Explorations- und Lernverhaltens untersucht. Interessanterweise stellte sich beim Vergleich mit Wildtyptieren heraus, dass nicht nur röntgenbestrahlte Rad54-/- Tiere sondern auch sham bestrahlte Kontrolltiere ein beeinträchtigtes Lernverhalten im Morris Water Maze-Test aufweisen. Motorische Fähigkeiten und Explorationsverhalten, die mit Hilfe des RotaRod- und Elevated Zero Maze-Tests überprüft wurden, sind hingegen nicht betroffen. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass zwischen dem spezifischen Defizit im komplexen räumlichen Lernen und der Anzahl an Doublecortin (DCX)-positiven Zellen im Gyrus dentatus der Rad54-/- Mäuse eine negative Korrelation besteht. Da DCX als Marker für junge Neurone etabliert ist, legt dieses Ergebnis die Schlussfolgerung nahe, dass eine gestörte adulte Neurogenese, die komplexe allozentrische Navigation erheblich beeinträchtigt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die NHEJ-Reparatur in verschiedenen neuronalen Zelltypen analysiert. Dazu diente das in vitro Stammzellsystem J1. Vorteil dieses minimalistischen Systems ist die Möglichkeit, neuronale Stammzellen in homogene Deszendentenkulturen zu differenzieren, sodass Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten unabhängig voneinander hinsichtlich ihrer Radiosensitivität untersucht werden können. Die Reparatur strahleninduzierter DNS DSBs wurde über die Immunfluoreszenzfärbung des Reparaturproteins 53BP1 verfolgt. Es zeigte sich, dass Neurone nach Bestrahlung mit 500 mGy eine drastisch verlangsamte Reparatur von DNS DSBs und eine signifikant reduzierte elektrische Spontanaktivität aufweisen. Die Spontanaktivität wurde über die Ableitung der Spannungsänderungen in der homogenen Neuronenkultur in einem Multielektrodenarray bestimmt. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass eine Impulsbehandlung über Nacht mit dem exzitatorischen Neurotransmitter Glutamat eine signifikante Steigerung der Reparatureffizienz von strahleninduzierten DNS DSBs in Neuronen bewirkt. Zusätzlich schützt Glutamat das neuronale Netzwerk vor einer strahleninduzierten Dysfunktion. Dieser Effekt konnte darauf zurückgeführt werden, dass spezifische Agonisten des glutamatergen Systems durch Bindung an spezifische NMDA-Rezeptoren einen ausschließlich in Neuronen vorkommenden Signalweg induzieren, der zur Aktivierung der Topoisomerase II-beta und in Folge dessen zur Transkription von immediate early genes führt. Diese verstärken die DNS-Schadensantwort und wirken so neuroprotektiv. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die neuronale Entwicklung sowohl im embryonalen als auch im postnatalen Status radiosensitiv ist und dass eine funktionale DNS DSB-Reparaturmaschinerie maßgebend für die einwandfreie Entwicklung und Funktion des neuronalen Netzwerkes ist.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Low-dose ionising radiation is frequently used in medical imaging and plays a crucial role in diagnostics. Computer tomographic examinations with low- dose X- rays are performed, especially on toddlers. In these connections, the head is the most frequently examined body part. Beside this, ionising radiation is used as therapeutic agent against tumor. In addition people are exposed to natural radiation during air and space travel. These are important reasons to study the effects of ionising radiation on the organism. The focus in this work is the analysis of radiation effects on the neuronal network. A direct and seriously damage of ionising radiation is the induction of DNA double strand breaks (DSBs). Proliferating cells, such as stem cells, have two main repair pathways to repair DNA DSBs: homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). Differentiated cells such as neurons and glial cells are dependent on the frequently defective repair pathway NHEJ. DNA DSBs which are not or incorrectly repaired lead to senescence, apoptosis or degenerated cells. These factors can support the pathogenesis of Alzheimer’s-, Parkinson’s- disease and tumor formation. To investigate the influence of a non- functional HR on radio sensitivity in the developing neural network, the HR- deficient Rad54-/- mouse model was chosen. The animals were irradiated with 500 mGy during neurologically disturbance- sensitive phases E14.5 and p10. Two months later, in adult stage, motor skills and exploration behaviour were analysed. Interestingly, the comparison with wild type animal’s exhibit that not only the radiated Rad54-/- mice show impaired learning behaviour in the Morris Water Maze- test, but also the sham irradiated control mice. Motor skills and exploration behaviour, which were assessed by the RotaRod- and Elevated Zero Maze-tests, are not affected. Furthermore, it was found that there is a negative correlation between the specific deficit in complex spatial learning and the number of doublecortin (DCX)-positive cells in the dentate gyrus of Rad54-/- mice. Because DCX is a marker for young neurons, the results suggest that impaired complex allocentric navigation is due to deranged adult neurogenesis. In the second part of this work, NHEJ-repair in different neuronal cell types was analyzed. For this purpose, the in vitro stem cell line J1 was differentiated to homogeneous descendant cultures of neurons, astrocytes and oligodendrocytes. This allowed each cell type to be independently tested for radio sensitivity. The repair of radiation-induced DNA DSBs was observed by immunofluorescence staining of the repair protein 53BP1. It was found a dramatically slowed down repair of DNA DSBs in neurons after irradiation with 500 mGy. In addition, the low-dose irradiation leads to a reduction of electrical spontaneous activity. The spontaneous activity was determined by deriving the voltage changes in the homogeneous neuron culture in a mutielectrode array. Interestingly, overnight treatment with the excitatory neurotransmitter glutamate significantly increases the repair efficiency of radiation-induced DNA DSBs in neurons. Additionally, glutamate protects the neural network from radiation-induced dysfunction. This effect could be attributed to the fact that agonists of the glutamatergic system, by binding to specific NMDA-receptors, induce a signalling pathway which is exclusively found in neurons. This signalling pathway leads to the activation of topoisomerase II-beta and consequently to the transcription of immediate early genes. These enhance the DNA damage response and thus have a neuroprotective effect. Overall, it could be shown that neuronal development, both in embryonic and postnatal status, is radiosensitive and that a functional DNA DSB repair is essential for the proper development and function of the neural network.

English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Neurophysiology and Neurosensory Systems
TU-Projects: Bund/BMBF|02NUK034B|NeuroRad Teil B
Date Deposited: 23 Dec 2020 08:49
Last Modified: 23 Dec 2020 08:50
DOI: 10.25534/tuprints-00015393
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-153937
Referees: Laube, Prof. Dr. Bodo ; Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 26 November 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/15393
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  • Kurz- und langfristige Auswirkungen strahleninduzierter DNS Doppelstrangbrüche auf das neuronale Netzwerk am in vitro und in vivo Mausmodell. (deposited 23 Dec 2020 08:49) [Currently Displayed]
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