TU Darmstadt / ULB / TUprints

Tailor-made antibodies by multidimensional functional screening

Hinz, Steffen (2021):
Tailor-made antibodies by multidimensional functional screening. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00014598,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Tailor-made antibodies by multidimensional functional screening
Language: English
Abstract:

The versatility of antibodies in modern life science or medicine is based not only on their ability to bind antigens with very high affinity but also on intrinsic stability, which allows for multiple protein engineering approaches to generate antibodies with tailor-made characteristics. This work focused on expanding the applicability of antibodies with responsive binding elements for in vitro and in vivo experiments while streamlining the screening process by optimizing the library preparation. The first project presented in this work focuses on pH-responsive sweeping bispecific antibodies (bsAbs). bsAbs comprise – in contrast to conventional antibodies – two antigen specificities that can be utilized to generate immunological synapses and subsequent target degradation. However, if solid tumor-associated antigens are targeted, bsAbs can suffer from antibody buffering if the antigen is also present in soluble form in the bloodstream, just as monospecific antibodies do. Recent publications describe the generation of recycling and sweeping antibodies which comprise pH-responsive or Calcium-responsive antigen binding in order to circumvent antibody buffering. This mechanism is based on the internalization of the antigen-antibody complex by endothelial cells and subsequent calcium concentration and pH change during vesicle maturation causing the antigen to dissociate. While the antibody is secreted and again able to bind antigen, the antigen is degraded in the forming lysosome. Our approach describes the first implementation of a recycling function into a bsAb equipped with common light chains. To this end, a histidine-doped common light chain library was generated based on the common light chain of a CEACAM5/CEACAM6 bsAb. This bsAb was isolated from an Omniflic immunization with the antigens CEACAM5 and CEACAM6, respectively, both relevant markers for colorectal cancer. As an additional goal, we aimed at introducing the pH-responsive binding solely for CEACAM5. The his-doped cLC library was screened for antigen-binding at pH 7.4 and antigen release at pH 5.0. Isolated candidates were characterized towards melting temperature and antigen affinity, only showing minor differences compared to the parental common light chain. More importantly, it was examined and confirmed that the generated common light chain remains a common light chain which can be used for a CEACAM5/CEACAM6 specific bsAb. This work mediates more profound insights into the engineering of common light chains for tailor-made binding characteristics resulting in a molecule where one antibody arm gains pH-responsive behavior while one arm remains pH-independent. The second investigation focuses on the generation of single chain Fragment variable molecules (scFvs) generated by chicken immunization as affinity ligands for affinity chromatography, expanding the utilization of chicken immunization derived antibody fragments. Affinity chromatography is a powerful tool to purify protein from complex solutions. Especially in the context of antibodies, naturally occurring ligands such as Protein A enable simplifying and accelerating the purification process. But the very high affinity of Protein A also comes with the drawback of requiring harsh elution conditions such as low pH or high ionic strength, resulting in antibody degradation during purification. Therefore, newly generated ligands for antibody purification are often engineered to include responsive binding elements allowing mild elution conditions during purification. We aimed at creating affinity ligands based on chicken antibodies, which are known for easy library generation, intrinsic thermal stability, and can be generated by a simple immunization process. Additionally, chickens are not mammals increasing the chance of provoking an immune reaction upon immunization with a mammal protein, unlike rodent hosts. Our chosen format – scFv – should also allow easy and fast production in bacterial hosts to ensure favorable production. The generated chicken scFv library could be utilized to isolate a plethora of different scFvs against our model protein, a human IgG scaffold. The resulting variants showed high affinity and comprised pH- and/or Magnesium-responsive binding behavior, which was an additional sorting criterion to enable mild elution conditions in a DSP setup in the end. After coupling the scFvs to a solid support, chromatographies were performed confirming the specificity as well as the pH-/Magnesium-responsive binding behavior in a DSP setup. Our experimental design proved to be a very time-efficient procedure to isolate potent affinity ligands enabling a mild elution purification of human proteins. The third part of this work focuses on the method of yeast display itself and the refinement thereof. The online monitoring during the sorting of yeast display libraries is enabled by immunofluorescent staining. Due to the staining, time has to be spent to prepare the library prior sorting. We developed an expression system where the surface presentation is entangled with intracellular tGFP expression to circumvent this procedure. To this end, a ribosomal skipping sequence (also known as 2A peptide) was genetically fused to the 3’ of the presented protein and 5’ of tGFP. Upon translation, the polypeptide chain is elongated until the last codon of the 2A peptide gene. A strand break occurs without causing the ribosome to stop but rather to continue translation with a second polypeptide chain (tGFP in this work) until a stop codon is recognized. This setup allows the detection of full-length surface protein constructs without utilizing immunological staining resulting in a more time- and cost-friendly alternative to immunological staining.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die Vielseitigkeit von Antikörpern in den modernen Biowissenschaften oder auch der Medizin beruht nicht nur auf ihrer Fähigkeit, Antigene mit sehr hoher Affinität zu binden, sondern auch auf der intrinsischen Stabilität, die es ermöglicht, Antikörper mit maßgeschneiderten Eigenschaften zu erzeugen. Das erste Projekt, das in dieser Arbeit vorgestellt wird, konzentrierte sich auf pH-schaltbare bispezifische Antikörper (bsAbs) mit sweeping-Funktion. bsAbs haben - im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörpern - zwei Antigenspezifitäten, die zur Erzeugung immunologischer Synapsen und nachfolgender Zielstrukturzerstörung genutzt werden können. Werden jedoch solide tumor-assoziierte Antigene anvisiert, kann antibody buffering die Wirksamkeit des bsAb minimieren, wenn das Antigen auch in löslicher Form im Blutstrom vorhanden ist. Ein Phänomen was insbesondere im Kontext von monoklonalen Antikörpern beschrieben wurde. In aktuellen Publikationen wird die Erzeugung von recycling- und sweeping-Antikörpern beschrieben, die eine pH- oder Kalzium-responsive Antigenbindung aufweisen, um antibody buffering zu umgehen. Zu diesem Zusammenhang wird der Antigen-Antikörper-Komplex von Endothelzellen internalisiert und bei Änderung der Kalziumkonzentration oder des pH Wertes dissoziiert das Antigen. Während der Antikörper sezerniert wird und wieder in der Lage ist, Antigen zu binden, wird das Antigen im Lysosom abgebaut. Unser Ansatz beschreibt die erste Implementierung einer Recyclingfunktion in einen bsAb, welcher common light chains (cLC) besitzt. Zu diesem Zweck wurde eine Histidin-angereicherte cLC-Bibliothek generiert und auf Antigen-Bindung bei pH 7,4 und Antigen-Freisetzung bei pH 5,0 durchmustert. Der parentale Antikörper wurde aus einer Immunisierung von OmniFlic Tieren mit den Kolorektalkarzinom-assoziierten Proteinen CEACAM5 und CEACAM6 generiert und in diesem Zusammenhang wurde auch die hier genutzt cLC entdeckt. Zusätzlich wurde beabsichtigt, die pH-Responsivität nur für eines der Antigene – CEACAM5 – zu implementieren. Die isolierten Kandidaten wurden hinsichtlich Schmelztemperatur und Antigenaffinität charakterisiert und zeigten nur geringe Unterschiede im Vergleich zur parentalen cLC. Wichtiger noch, es wurde untersucht und bestätigt, dass die erzeugte cLC ihre Eigenschaften als cLC behält und für einen CEACAM5/CEACAM6-spezifisches bsAb verwendet werden kann. Diese Arbeit vermittelt tiefere Einblicke in cLCs und zeigt, dass cLCs detailliert auf Einzelanwendungs-spezifische Anforderungen zugeschnitten werden können. In der dargestellten Arbeit war dies die Etablierung von pH-Responsivität für nur eine der beiden Antigen-Bindestellen. Die zweite Untersuchung konzentrierte sich auf die Erzeugung von Hühnerantikörperfragmenten im Format der single chain Fragment variable (scFv) basierend auf Hühnerimmunisierungen, um die Verwendung von Hühnerantikörpern als Affinitätsliganden in Proteinreinigungsverfahren zu untersuchen. Die Affinitätschromatographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Reinigung von Proteinen aus komplexen Lösungen. Insbesondere im Zusammenhang mit Antikörpern ermöglichen natürlich vorkommende Liganden wie Protein A nicht nur eine Vereinfachung, sondern auch eine Beschleunigung des Reinigungsprozesses. Jedoch ist die hohe Affinität von Protein A zu Immunoglobulinen zeitgleich ein entscheidender Nachteil während des Reinigungsprozesses, da hierdurch harsche Elutionsbedingungen wie beispielsweise Puffer mit niedrigem pH-Wert oder hoher Ionenstärke benötigt werden, welche Ausbeuteverluste durch Proteindegradation zur Folge haben könnten. Dies ist einer der Gründe, wieso für die Reinigung von Antikörpern oft Affinitätsliganden erzeugt werden, welche intrisische Responsivitätselemente aufweisen, die mildere Elutionsbedingungen ermöglichen. Wir wollten Affinitätsliganden auf der Basis von Hühnerantikörpern erzeugen. Hühner-Antikörper sind für eine einfache Bibliothekserzeugung und intrinsische thermische Stabilität bekannt und können durch einen einfachen Immunisierungsprozess erzeugt werden. Darüber hinaus sind Hühner keine Säugetiere, was die Chance erhöht, bei Immunisierung mit einem Säugetierprotein im Gegensatz zu Nagetierwirten eine Immunreaktion auszulösen. Für unsere Studien wählten wir das scFv-Format, um eine kostengünstige und einfache Herstellung durch bakterielle Expression zu ermöglichen. Unsere generierte Hühner-scFv-Bibliothek konnte verwendet werden, um eine Vielzahl verschiedener scFvs gegen unser Modellprotein - ein humaner IgG Antikörper - zu isolieren, die nicht nur eine hohe Affinität aufwiesen, sondern auch ein pH- und/oder Magnesium-responsives Bindungsverhalten zeigten. Dies sollte als zusätzliches Sortierkriterium milde Elutionsbedingungen in einem Downstream Processing Setup (DSP) ermöglichen. Nach der Kopplung der scFvs an ein voraktiviertes Festphase wurden Chromatographien durchgeführt, die sowohl die Spezifität als auch das pH /Magnesium-responsive Bindungsverhalten in einem DSP-Setup bestätigten. Unser experimentelles Design erwies sich als ein sehr zeiteffizientes Verfahren zur Isolierung potenter Affinitätsliganden für die Reinigung menschlicher Proteine unter Anwendung milder Elutionsbedingungen. Der dritte Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Methode des Hefe-Displays selbst und dessen Verbesserung. Das Online-Monitoring bei der Sortierung von Hefe-Display-Bibliotheken wird durch Immunfluoreszenzfärbung ermöglicht. Aufgrund der Färbung muss vor der Sortierung Zeit für die Vorbereitung der Bibliothek aufgewendet werden. Um dieses Verfahren zu umgehen, haben wir ein Expressionssystem entwickelt, bei dem die Oberflächenpräsentation mit intrazellulärer tGFP-Expression gekoppelt ist. Zu diesem Zweck wurde eine ribosomale Skipping-Sequenz (auch als 2A-Peptid bekannt) genetisch mit dem 3'-Ende des präsentierten Proteins und dem 5'-Ende von tGFP verknüpft. Nach der Translation wird die Polypeptidkette bis zum letzten Codon des 2A-Peptidgens verlängert, wo ein Strangbruch stattfindet, ohne dass das Ribosom stoppt, sondern die Translation mit einer zweiten Polypeptidkette (in dieser Arbeit tGFP) fortgesetzt wird, bis ein Stoppcodon erkannt wird. Dieser Aufbau ermöglicht den Nachweis von Oberflächenproteinkonstrukten in voller Länge ohne Verwendung von immunologischer Färbung, was eine zeit- und kostenfreundlichere Alternative zur immunologischen Färbung darstellt.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: xii, 95 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 13 Jul 2021 10:53
Last Modified: 13 Jul 2021 10:53
DOI: 10.26083/tuprints-00014598
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-145982
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Neumann, Prof. Dr. Siegfried ; Suess, Prof. Dr. Beatrix ; Meckel, PD Dr. Tobias
Refereed: 1 February 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/14598
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