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Beyond mere flexibility: Functional Peptide Linkers in Engineered Nanosensors and -switches

Gräwe, Alexander (2020):
Beyond mere flexibility: Functional Peptide Linkers in Engineered Nanosensors and -switches. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00014535,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Beyond mere flexibility: Functional Peptide Linkers in Engineered Nanosensors and -switches
Language: English
Abstract:

Human health monitoring, disease diagnosis and therapeutics rely on the detection of biomolecules. In this regard, Synthetic Biology approaches based on tailored molecular receptors and actuators can create powerful biosensing platforms. To achieve an optimal biosensor, the composition of such receptor/actuator scaffolds requires both careful design and thorough screening. Thus, my PhD studies focused on construction principles that render modular fusion proteins powerful biosensors. Central to the functionality of fusion proteins are the domain-connecting peptidic linkers. While the importance of linkers is known, methods to systematically screen the underlying amino acid space are scarce. Therefore, a novel DNA assembly method was devised that enables straightforward cloning of large and diverse linker libraries. By applying the strategy to synthetic protein switches, I identified multiple potent ligand-responsive proteases. The importance of linkers was further assessed by investigating the behavior of nanopore scaffolds based on the β-barrel transmembrane protein FhuA ΔcΔ5L. The linker between the transmembrane domain and engineered terminal receptor tags emerged as a crucial parameter, impacting both open probability and intermolecular interaction ability of the nanopore in artificial lipid bilayers. An engineered ΔcΔ5L variant could irreversibly catch a second fusion protein while embedded into the bilayer, demonstrating biosensing at the single molecule level. While biological nanopores are highly specific, their lack of stability complicates their use in application-oriented biosensors. Considering this, a strategy to stably immobilize fusion protein receptors in solid-state nanopores was developed in collaboration with Ivana Duznovic from the Materials analysis group. Highly specific nanobodies attached to conical nanopores in track-etched poly(ethylene terephthalate) (PET) membranes allowed sensitive discrimination of analytes by current-voltage (I-V) measurements. The developed nanobody-nanopore platform constitutes a highly modular biosensing system and can potentially be combined with lab-on-chip devices. In the first chapter, I embed my dissertation in the context of Synthetic Biology and Nanosensors while outlining the content of the following chapters. The second chapter describes the development of a cloning strategy for protein linkers and its application to synthetic protein switches. The third chapter deals with the biological nanopore scaffold ΔcΔ5L, while the fourth chapter describes the development of solid-state nanopore biosensing platform.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die Detektion von Biomolekülen ist von entscheidender Bedeutung sowohl in der Diagnostik von Krankheiten wie auch in der Therapeutik und bei Vorsorgeuntersuchungen. In diesem Sinne ermöglicht die Synthetische Biologie die Konstruktion wirkungsvoller Biosensorik-Plattformen auf Basis von molekularen Rezeptoren und Aktuatoren. Ein optimaler Biosensor lässt sich nur durch umsichtiges Design und nach umfassendem Screening identifizieren. In meiner Promotion habe ich mich daher intensiv mit Konstruktionsprinzipien befasst, die es ermöglichen, aus modularen Fusionsproteinen wirkungsvolle Biosensoren zu generieren. Die Proteinlinker zwischen den einzelnen Domänen von Fusionsproteinen sind für die Funktionalität Letzerer zentral. Obwohl diese Bedeutung bekannt ist, existieren bisher nur wenige Methoden, die eine systematische Untersuchung der Linker erlauben. Daher wurde eine neuartige Strategie zur DNA-Assemblierung entwickelt, die das Klonieren umfangreicher Linker-Bibliotheken ermöglicht. Bei der Anwendung dieser Strategie auf synthetische Proteinschalter habe ich mehrere schlagkräftige Proteasen identifiziert, die auf Liganden reagieren. Dass Linker auch in einem anderen Kontext von entscheidender Bedeutung sind, wurde durch die Charakterisierung verschiedener Varianten der β-Fass Transmembran-Nanopore FhuA ΔcΔ5L gezeigt, die in artifiziellen Lipid-Bilayern vermessen wurden. Der Linker zwischen der Transmembran-Domäne und maßgeschneiderten terminalen Rezeptorpeptiden stellte sich als entscheidender Parameter heraus, der sowohl Offenwahrscheinlichkeit als auch die Fähigkeit der Pore, mit anderen Molekülen zu interagieren, beeinflusste. Eine maßgeschneiderte ΔcΔ5L Variante verknüpfte sich irreversibel mit einem zweiten Fusionsprotein, während sie im Bilayer verankert war. Dadurch wurde aufgezeigt, dass das System als Biosensor im Einzelmolekülmaßstab funktioniert. Biologische Nanoporen sind zwar hochspezifisch, aber strukturell anfällig. Daher ist ihr Einsatz in anwendungsorientierten Biosensoren mit Schwierigkeiten verbunden. Als Alternative wurde eine Strategie zur stabilen Immobilisierung von Fusionsprotein-Rezeptoren in ionenspur-geätzten PET-Folien entwickelt, in enger Zusammenarbeit mit Ivana Duznovic aus der Arbeitsgruppe Materialanalytik. Die Anbringung hochspezifischer Nanobodies an konische Nanoporen erlaubte die sensitive Unterscheidung von Analyten durch Strom-Spannungs-Messungen (I-V Messungen). Die entwickelte Nanobody-Nanoporen-Biosensor-Plattform ist hochmodular und potentiell kombinierbar mit der Lab-on-Chip Technologie. Im ersten Kapitel setze ich meine Dissertation in den Kontext von Synthetischer Biologie und Nanosensoren und gehe auf die entsprechenden Berührungspunkte ein, die in den folgenden Kapiteln beschrieben werden. Das zweite Kapitel beschreibt die Entwicklung einer Klonierungsstrategie für Protein-Linker und deren Anwendung anhand synthetischer Proteinschalter. Das dritte Kapitel behandelt die biologische Nanopore ΔcΔ5L, während sich das vierte Kapitel der Enwicklung einer Biosensorik-Plattform auf Basis von Festkörper-Nanoporen widmet.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: IV, 143 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Protein Engineering of Ion Conducting Nanopores
Date Deposited: 08 Dec 2020 09:59
Last Modified: 08 Dec 2020 09:59
DOI: 10.25534/tuprints-00014535
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-145355
Referees: Stein, Prof. Dr. Viktor and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 25 September 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/14535
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