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Potential hyperaktiver Gerinnungsfaktor IX Varianten für den Einsatz in der Hämophilie B Therapie

Urbanowitz, Ann-Kathrin (2020):
Potential hyperaktiver Gerinnungsfaktor IX Varianten für den Einsatz in der Hämophilie B Therapie. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00014421,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Potential hyperaktiver Gerinnungsfaktor IX Varianten für den Einsatz in der Hämophilie B Therapie
Language: German
Abstract:

Die Hämophilie ist eine X-chromosomal vererbte Blutgerinnungsstörung und kann aufgrund des Mangels an Gerinnungsfaktor VIII oder FIX in die Hämophilie A respektive Hämophilie B unterschieden werden (129). Die Unterteilung in die Schweregrade schwer, moderat und mild beeinflusst sowohl die klinische Manifestation als auch die Langzeitprognose für die Patienten (214). Insbesondere bei der schweren Verlaufsform der Hämophilie wird eine prophylaktische Substitution der Patienten mit dem jeweiligen fehlenden Gerinnungsfaktor angestrebt, mit dem Ziel den Schwellenwert der Gerinnungsfaktorspiegel im Plasma stets über 1% zu halten und somit das Auftreten von spontanen Blutungen in Muskeln und Gelenke weitestgehend zu verhindern (57;199). Aufgrund der geringen Halbwertszeit von maximal 24 Stunden für FIX müssen sich die Patienten zwei- bis dreimal wöchentlich dieser Substitutionsprozedur unterziehen, was nicht nur eine Einschränkung der Lebensqualität zur Folge hat sondern darüber hinaus auch ein gesundheitliches Risiko darstellt (117;124). Daher wurde die Entwicklung einer Gentherapie zur Behandlung der Hämophilie in den letzten Jahren progressiv vorangetrieben. Die Hämophilie bietet dahingehend zweierlei Vorteile: zum einen handelt es sich um einen monogenetischen Defekt und zum anderen haben geringe Korrekturen der Gerinnungsfaktor Aktivitäten bereits einen enormen Einfluss auf die klinische Prognose für die Patienten. Das ursprüngliche Ziel, den Schwellenwert der Gerinnungsfaktor Aktivität über 1% zu halten, wurde bereits durch diverse Optimierungsprozesse, wie der Verwendung von selbstkomplementären und leberspezifischen AAV Serotypen, einer Kodon Optimierung des FIX Transgens und der Entwicklung von starken aber dennoch leberspezifischen Promotoren, erreicht. Hierdurch war es möglich mittels AAV Gentherapie in Hämophilie B Patienten bereits ein FIX Aktivitätsmaximum von 12% zu erreichen (132;150-154). Dieses Expressionsmaximum konnte zudem noch durch die Verwendung der sogenannten Padua Mutante des FIX Transgens gesteigert werden (69). Die Padua Mutation wurde erstmals 2009 von Simioni und Kollegen beobachtet und beschreibt genetisch die Substitution der Aminosäure Arginin gegen Leucin an Position 338, welches eine bis zu 8-fach gesteigerte FIX Aktivität trotz physiologischen Antigenspiegeln im Plasma zur Folge hat (196). Trotz der vielversprechenden Entwicklung der Gentherapie in Hinblick auf die erreichten FIX Aktivitäten sind neue, aus den präklinischen Studien in Tiermodellen nicht vorhersagbare Probleme aufgetreten. Hierzu zählt ein mit der AAV Gentherapie verbundener Anstieg an Transaminasen als Anzeichen einer Lebertoxizität. Als Ursache hierfür werden zurzeit zwei verschiedene Mechanismen diskutiert. Zum einen die Präsentation von Kapsid Strukturen über die MHC-I und MHC-II Komplexe und der damit einhergehenden Auslösung einer zytotoxischen T Zell Antwort gegen transduzierte Hepatozyten (84;135-138). Zum anderen eine Stressreaktion transduzierter Hepatozyten durch eine übermäßige Proteinexpression ausgelöst durch eine strikt perivaskulär limitierte Transduktion (132). Beide Mechanismen haben einen Zusammenhang mit der für die AAV Gentherapie verwendeten Vektordosis gemein. Daraus resultiert das momentane (Haupt)Bestreben die Vektordosis für die AAV Gentherapie weiter zu reduzieren ohne dabei den minimal notwendigen FIX Aktivitätsspiegel im Plasma zu verlieren. Aus diesem Grund wurden in diesem Labor zwei weitere hyperaktive FIX Mutanten generiert. Eine zusätzliche Aktivitätssteigerung um das 20-fache verglichen mit dem Wildtyp FIX Protein wurde durch den Austausch der Aminosäure Serin gegen Tryptophan an Position 377 erreicht (171) und fortan als FIX LW bezeichnet. Die FIX KLW Variante wurde durch den zusätzlichen Austausch der Aminosäure Valin gegen Lysin an Position 10 erweitert (30), die dadurch bedingte verminderte Kollagen Typ IV Bindungsaffinität konnte auch in dieser Arbeit mit einem Kollagen Typ IV Bindungs Assay bestätigt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit erfolgte die Generierung der für Proteinproduktion im großen Maßstab benötigten Zelllinien durch lentivirale Transduktion der HEK293T Zelllinie mit der jeweiligen FIX Variante als Transgen gefolgt von der Charakterisierung sowie Expansion geeigneter Zellklone. Die in vitro Charakterisierung dieser Zellklone zeigte zwar eine reduzierte Expression der mutierten FIX Varianten, was allerdings weder durch Sekretionsanalysen noch durch Untersuchungen zum intrazellulären Transport mechanistisch erklärt werden konnte. Auch der mittels SDS-PAGE sichtbar gemachte Glykosylierungsstatus schien quantitativ zwischen den FIX Proteinen vergleichbar gewesen zu sein. Die Aufreinigung der für die in vivo Experimente benötigten rekombinanten FIX Proteine wurden ebenfalls in dieser Doktorarbeit etabliert und erfolgte mittels Anionen-Austausch-Chromatographie. Funktionalitätsanalysen der rekombinanten FIX Proteine zeigten eine 5-fach gesteigerte Aktivität der Padua Variante gegenüber dem Wildtyp, wohingegen die FIX LW und FIX KLW Varianten eine zusätzliche Steigerung um das 7 bis 8-fache aufwiesen. Die Abwesenheit von durch die Aufreinigung verursachtem voraktiviertem FIXa konnte durch die Visualisierung der Proteine mittels Western Blot sowie die Anwendung eines chromogenen Assays gegen FIXa bewiesen werden. Durch die Veränderung der Proteinsequenz und der damit verbundenen möglichen Entstehung von neuen Epitopen wurde im nächsten Teil der Arbeit das immunogene Potential der FIX Varianten in zwei experimentellen Ansätzen untersucht. Die intramuskuläre Injektion der FIX Proteinvarianten in Hämophilie B Mäusen führte immunologisch zu keiner Reaktion. Erst die Kombination der FIX Proteinvarianten mit dem inkompletten Freundschen Adjuvans und der zweimaligen subkutanen Injektion führte zu einem drastischen Anstieg der FIX IgG1 Konzentration in den Mausplasmen. Es konnte zwar tendenziell sogar ein geringerer Anstieg der FIX IgG1 Konzentration bei den drei hyperaktiven Varianten im Vergleich zum Wildtyp FIX beobachtet werden allerdings ohne statistische Signifikanz, so dass zum aktuellen Stand von keiner gesteigerten Immunogenität durch die Einzelnukleotidaustausche auszugehen ist. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die pharmakokinetische Charakterisierung der FIX Proteinvarianten. Durch subkutane oder intravenöse Injektion der aufgereinigten FIX Proteine und retroorbitale Blutentnahme zu definierten Zeitinterwallen wurde sowohl die extravaskuläre Umverteilung als auch die Eliminierung der FIX Proteine aus dem Plasma von Hämophilie B Mäusen untersucht. Hierbei zeigte die KLW Variante aufgrund der verminderten Bindung an Kollagen TypIV und der damit verbundenen reduzierten extravaskulären Sequestrierung eine deutlich erhöhte Bioverfügbarkeit im Plasma sowohl nach subkutaner als auch intravenöser Injektion. Pharmakokinetische Analysen unter Annahme eines Zwei-Kompartimenten Systems zeigten hingegen eine deutlich gesteigerte Elimination der FIX KLW Variante aus dem Plasma, welches beispielsweise durch eine Halbwertszeit verlängerte Modifikation korrigiert werden könnte. Als letzten Teilaspekt in dieser Doktorarbeit wurden die neu generierten hyperaktiven FIX Varianten auf ihr Potential für ihren Einsatz in der Gentherapie hin untersucht. Die Überprüfung der Effizienz erfolgte unter Verwendung einer niedrigen Dosisstufe mit 5x1010 vg/kg. Die errechnete spezifische Aktivität ergab eine 5-fach gesteigerte Aktivität der Padua Variante verglichen mit dem FIX Wildtyp. Die Verwendung der FIX LW und KLW Variante als Transgen resultierte sogar in einer 14- fach gesteigerten spezifischen Aktivität verglichen mit dem Wildtyp. Auffällig war auch in diesem Teilabschnitt die verminderte Proteinexpression der hyperaktiven FIX Proteinvarianten im Vergleich zum Wildtyp, dies konnte allerdings mit den in dieser Arbeit erhobenen Daten mechanistisch nicht begründet werden. Die Verwendung einer hohen Dosisstufe mit 2x1011 vg/kg sollte Rückschlüsse auf eine mögliche erhöhte Thrombogenität ausgelöst durch die Hyperaktivität liefern. Dies konnte allerdings mit Bestimmung der Konzentration an D-Dimeren und Thrombin-Antithrombin-Komplexen in Plasmen gentherapierter Hämophilie B Mäuse als nicht relevant bestätigt werden. Es konnte auch keine erhöhte Immunogenität der FIX Varianten in gentherapiertet Mäuse nachgewiesen werden, sodass die hyperaktiven Varianten LW und KLW diesbezüglich sicher zu sein scheinen und in der AAV Gentherapie getestet werden können. Des Weiteren ist der Einsatz der FIX KLW Variante für die Etablierung einer subkutan zu applizierenden Substitutionstherapie denkbar, vergleichend mit dem zurzeit in klinischen Studien getesteten Dalcinonacog alpha (NCT03995784).

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Hemophilia is an X-linked inherited blood coagulation disorder and can be classified as hemophilia A or hemophilia B, respectively, due to the lack of coagulation factor VIII or FIX (129). The classification into severe, moderate and mild affects both clinical manifestation and long-term prognosis for patients (214). In the severe form of haemophilia in particular, prophylactic substitution of patients with the respective missing coagulation factor is aimed at keeping the threshold value of the coagulation factor levels in the plasma above 1% at all times and thus preventing the occurrence of spontaneous bleeding in muscles and joints as far as possible (57;199). Due to the short half-life of maximum 24 hours for FIX, patients have to undergo this Substitution procedure two to three times a week, which not only results in a loss of quality of life, but also poses a health risk (117;124). Therefore, the development of a gene therapy for the treatment of hemophilia has been progressively advanced in recent years. In this respect, hemophilia offers two advantages: on the one hand, it is a monogenetic defect and, on the other hand, minor corrections to the coagulation factor activities already have an enormous influence on the clinical prognosis for patients. The original goal of keeping the threshold of coagulation factor activity above 1% has already been achieved through various optimization processes, such as the use of self-complementary and liver-specific AAV serotypes, a codon optimization of the FIX transgene and the development of strong but nevertheless liver-specific promoters. By this it was possible to achieve a FIX activity maximum of 12% in hemophilia B patients using AAV gene therapy (132;150-154). This expression maximum could also be increased by using the so-called Padua mutant of the FIX transgene (69). The Padua mutation was first observed by Simioni and colleagues in 2009 and genetically describes the Substitution of the amino acid arginine for leucine at position 338, which results in an up to 8-fold increase in FIX activity despite physiological antigen levels in the plasma (196). Despite the promising development of gene therapy with regard to the achieved FIX activities, new problems have arisen that could not be predicted from preclinical studies in animal models. These include an increase in transaminases associated with AAV gene therapy as an indication of liver toxicity. Two different mechanisms are currently being discussed as the cause of this. One is the presentation of capsid structures via the MHCI and MHC-II complexes and the associated triggering of a cytotoxic T cell Response against transduced hepatocytes (84;135;137;138). On the other hand, a stress Response of transduced hepatocytes by excessive protein expression triggered by a strictly perivascularly limited transduction (132). Both mechanisms have in common a realtionship with the vector dose used for AAV gene therapy. As a result, in the current (main) aim is to further reduce the vector dose for AAV gene therapy without losing the minimum necessary FIX activity level in the plasma. For this reason, two additional hyperactive FIX mutants were generated in this laboratory. An additional 20-fold increase in activity compared to the wild-type FIX was achieved by replacing the amino acid serine with tryptophan at position 377 (171) and henceforth called FIX LW. The FIX KLW variant was extended by the additional exchange of the amino acid valine for lysine at position 10 (30), the resulting reduced collagen type IV binding affinity could also be confirmed in this work with a collagen type IV binding assay. In the first part of this work, the generation of the cell lines required for large-scale protein production was performed by lentiviral transduction of the HEK293T cell line with the respective FIX variant as transgene followed by the characterization and expansion of suitable cell clones. The in vitro characterization of these cell clones showed a reduced expression of the mutated FIX variants, but this could not be mechanistically explained either by secretion analyzes or by studies on intracellular transport. Also the glycosylation status visualized by SDS-PAGE seemed to be quantitatively comparable between the FIX proteins. The purification of the recombinant FIX proteins required for the in vivo experiments was also established in this PhD thesis and was performed by anion exchange chromatography. Functionality analyses of the recombinant FIX proteins showed a 5-fold increase in activity of the Padua variant compared to the wild type, whereas the FIX LW and FIX KLW variants showed an additional 7- to 8-fold increase. The absence of preactivated FIXa caused by purification was demonstrated by visualizing the proteins by Western Blot and the application of a chromogenic assay against FIXa. Due to the changes of protein sequenze and the associated possible formation of new epitopes, the immunogenic potential of the FIX variants was investigated in the next part of this PhD thesis in two experimental approaches. The intramuscular injection of the FIX protein variants into hemophilia B mice did not lead to an immunological reaction. Only the combination of the FIX protein variants with the incomplete Freund's adjuvant and two subcutaneous injections led to a drastic increase in the FIX IgG1 concentration in the mouse plasmas. A slight increase in the FIX IgG1 concentration was observed in the three hyperactive variants compared to the wild-type FIX, but without statistical significance, so that at the current level, no increased immunogenicity can be assumed from the individual nucleotide exchanges. Another aspect of this work was the pharmacokinetic characterization of the FIX protein variants. By subcutaneous or intravenous injection of the purified FIX Proteins and retroorbital blood sampling at defined time intervals, both extravascular redistribution and elimination of the FIX proteins from the plasma of hemophilia B mice were investigated. Due to the reduced binding to type IV collagen and the associated reduced extravascular sequestration, the KLW variant showed a significantly increased bioavailability in plasma both after subcutaneous and intravenous injection. Pharmacokinetic analyzes using a two-compartment system showed a significantly increased elimination of the FIX KLW variant from the plasma, which could be corrected by e.g. a half-life extended modification. As a final partial aspect in this thesis the newly generated hyperactive variants were examined for their potential for the use in AAV gene therapy. The efficiency was tested using a low dose level of 5x1010 vg/kg. The calculated specific activity resulted in a 5- fold increase in activity of the Padua variant compared to the wild type FIX. The use of the FIX LW and KLW variant as transgene even resulted in a 14-fold increase in specific activity compared to the wild type. The reduced protein expression of the hyperactive FIX protein variants compared to the wild type was also noticeable in this sub-section butr this could not be mechanistically justified with the data collected in this study. The use of a high dose level of 2x1011 vg/kg should provide conclusions on a possible increased thrombogenicity caused by hyperactivity. However, this could be confirmed as irrrelevant by determining the concentration of D-dimers and thrombin- Antithrombin complexes in plasmas of genetically treated hemophilia B mice. No increased immunogenicity of the FIX variants in gene-treated mice could be detected, so that the hyperactive variants LW and KLW seems to be and can be evaluated in human AAV gene therapy. Furthermore, the use of the FIX KLW variant for the establishment of a subcutaneous substitution therapy is conceivable, compared to the Dalcinonacog alpha (NCT03995784) currently being tested in clinical trials.

English
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 155 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 01 Dec 2020 11:11
Last Modified: 01 Dec 2020 11:11
DOI: 10.25534/tuprints-00014421
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-144214
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix ; Bönig, Prof. Dr. Halvard
Refereed: 22 October 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/14421
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