Isolierung und Charakterisierung eines bakteriellen Prothrombin-Aktivators

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden 11 Bakterienstämme auf die Fähigkeit zur Bildung eines Prothrombin-Aktivators hin untersucht. Diese Untersuchung führte zur Entdeckung und Isolierung einer Prothrombin aktivierenden Aktivität aus dem fakultativ humanpathogenen Wasserkeim Aeromonas hydrophila, der Fischinfektionen und Durchfall beim Menschen verursacht. Datenbankrecherchen ergaben eine 90 %ige Sequenzidentität sowohl mit der Pro-Aminopeptidase Processing Protease aus Aeromonas caviae, als auch mit einer Elastase aus Aeromonas hydrophila. Der Prothrombin-Aktivator wurde biochemisch charakterisiert. Es handelt sich um eine einkettige Metalloprotease, die ein Molekulargewicht von 35 kDa und einen isoelektrischen Punkt bei pI = 4,4 aufweist. Die enzymatische Aktivität ist thermostabil und bleibt bis zu einer Temperatur von 55°C vollständig erhalten. Maximale Aktivität zeigt sich bei pH 6 in Gegenwart von 0 bzw. 1,5 M NaCl. Die Michaelis-Menten-Konstante KM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax für die Prothrombin-Aktivierung betragen 1,77 (1,47) µM und 0,81 (1,66) mol/(min * mol Enzym) bei einer NaCl-Konzentration von 0 (1,5) M. Eine Analyse der Prothrombin-Spaltprodukte zeigte, dass unter anderem authentisches Thrombin entsteht, das seinerseits weiter abgebaut wird. Neben Prothrombin werden weitere Plasmaproteine (u.a. Fibrinogen und alpha2-Makroglobulin) gespalten. Ein fluorogenes Testsystem wurde etabliert, das die Bestimmung des Prothrombin-Gehalts in Plasma mit Hilfe der bakteriellen Protease mit hoher Sensitivität und Genauigkeit ermöglicht. Die vorliegenden Erkenntnisse lassen einen Einsatz des Enzyms als analytisches Werkzeug im Bereich der Gerinnungsdiagnostik als möglich erscheinen. Eventuell wäre es eine billigere und in größeren Mengen erzeugbare Alternative zu herkömmlichen Prothrombin-Aktivatoren aus Schlangengiften, die im Bereich der Gerinnungsanalytik eingesetzt werden, wie beispielsweise dem Ecarin aus dem Gift der Schlange Echis carinatus.