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Ultra-High-Throughput Single-Cell Functional Screening by Combination of Microfluidics and GMD-FACS

Yanakieva, Desislava (2020):
Ultra-High-Throughput Single-Cell Functional Screening by Combination of Microfluidics and GMD-FACS.
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00013464,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Ultra-High-Throughput Single-Cell Functional Screening by Combination of Microfluidics and GMD-FACS
Language: English
Abstract:

Aim of this work was the establishment and validation of a novel generic functional screening approach for selection of protein variants with desired biological function in an ultra-high-throughput manner. This new process is based on the combination of a S. cerevisiae secretion host, capable of high transformation efficiencies and compatible with high-diversity protein libraries, with a mammalian-based reporter system for activity-dependent fluorescence readout of functional molecules. This strategy represents the base of a straightforward selection platform for testing a high number of different protein molecules for desired biological function. Compartmentalization of the secretor and reporter cells in distinct microreactors enables phenotype-genotype coupling while miniaturization of the test assays to volumes in the picolitre range brings the advantage of rapid biochemical reactions by fast accumulation of secreted molecules. Microfluidic-assisted encapsulation of the two cell types supports the generation of microdroplets with high speed and precision and implementation of hydrogel-forming polymers enables the recovery of uniform hydrogel microbeads surrounding the encapsulated cells. This strategy makes the system compatible to ultra-high throughput fluorescence-activated cell sorting on a commercially available device and enables the screening of high diversity protein libraries.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Ziele dieser Arbeit waren die Etablierung und Validierung eines neuen generischen Verfahrens für die direkte Selektion funktioneller Proteinvarianten mit vorgeschriebener biologischer Wirkweise in einem Ultra-Hoch- Durchsatz Prozess. Für diesen Zweck wurden S. cerevisiae Hefezellen als Sekretionswirt eingesetzt, da deren hohe Transformationseffizienz und Kompatibilität zu hoch-diversen Protein Bibliotheken ein wichtiges Merkmal darstellt. In Kombination mit den Hefezellen wurden Säugertier Reporterzellen verwendet, um aktivitätsabhängige fluoreszente Signale, welche auf einen erwünschten Wirkmechanismus hinweisen, zu erhalten. Diese Strategie bildet die Grundlage einer neuen Selektionsplattform, welche die Dursuchung einer hohen Anzahl verschiedener Proteine nach gewünschter biologischer Funktion ermöglicht. Die Kompartimentierung eines Gemisches aus Hefe- und Reporterzellen resultiert in Mikroreaktoren, in denen eine Phänotyp-Genotyp Kopplung gewährleistet ist. Durch das geringe Volumen, welches sich im Picoliter Maßstab bewegt, findet eine schnelle und effiziente Akkumulation von sekretierten bioaktiven Molekülen statt. Durch den Einsatz mikrofluidischer Verfahren können beide Zelltypen schnell und hoch-präzise in Mikrotröpfchen verpackt werden. Hydrogel-bildendende Polymere ermöglichen die Erzeugung von uniformen kugelähnlichen Mikroreaktoren, welche sowohl Hefe- als auch Reporterzellen in sich tragen. Diese Strategie macht das System kompatibel mit Ultra-Hoch-Durchsatz Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung und ermöglicht den Einsatz von herkömmlichen kommerziell erhältlichen Sortiergeräten zur Durchmusterung von Protein-Bibliotheken mit hoher Diversität.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 10 Sep 2020 11:51
Last Modified: 10 Sep 2020 11:51
DOI: 10.25534/tuprints-00013464
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-134645
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Neumann, Prof. Dr. Siegfried
Refereed: 27 July 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/13464
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