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ER export of the plant K+ channel KAT1: Identification and functional analysis of acidic signal motifs

Mikosch, Melanie :
ER export of the plant K+ channel KAT1: Identification and functional analysis of acidic signal motifs.
TU Darmstadt/ Biologie
[Ph.D. Thesis], (2009)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: ER export of the plant K+ channel KAT1: Identification and functional analysis of acidic signal motifs
Language: English
Abstract:

Membrane proteins, like the K+ channel, are transported to the plasma membrane through the secretory pathway. In this study it was shown for the first time that ER export motifs, which play an important role in the transport of membrane proteins, are functional in plant cells. A diacidic ER export motif was identified in the K+ channel KAT1 from Arabidopsis thaliana. This motif was shown to be required for efficient transport of the protein to the plasma membrane. Mutation of the diacidic motif resulted in ER retention of KAT1 in Vicia faba guard cells and in HEK293 cells. Further analysis of the diacidic motif and the surrounding amino acids revealed that the diacidic motif was not only diacidic but contained at least three acid residues at position D392, D394 and E396. Patch clamp studies demonstrated that the ER export was almost completely inhibited only when all three acidic amino acids were mutated to alanine. Mutation of one or two of the three residues led to a reduction of conductance corresponding to the number of mutated residues. Confocal analysis of these mutants revealed an almost complete ER retention for K+ channels with three and two mutated acidic amino acids but a clear plasma membrane staining for mutation of only one acidic amino acid. Plasma membrane localisation of the ER export mutant of KAT1 could be rescued upon heterotetramerisation with the wildtype KAT1 channel. Therefore, ER export motifs can affect also subunit composition of K+ channel tetramers in the plasma membrane. Functional analysis of the identified ER export motif by FRET measurements demonstrated that KAT1 binds to Sec24, a subunit of COPII. The interaction of the K+ channel KAT1 with Sec24 was dependent on the acidic ER export motif. This implies that binding of the diacidic motif of KAT1 to Sec24 is essential for recruitment of the channel into COPII vesicles and efficient export out of the ER. Altogether, the experiments show that ER export signals are crucial for the regulation of ion channel density and composition. Analysis of ER export of KAT1 in plant and animal cells implies that the mechanism of ER export is highly conserved among eukaryotes.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Membranproteine wie der Kaliumkanal KAT1 werden entlang des sekretorischen Weges zur Plasmamembran transportiert. Diese Studie konnte zum ersten Mal zeigen, dass auch in pflanzlichen Zellen ER Exportmotive an der Regulation dieses Transportes beteiligt sind. Im C-Terminus des Kaliumkanals KAT1 wurde eine Signalsequenz aus zwei sauren Aminosäuren identifiziert, die für den effizienten Transport des Kanals zur Plasmamembran verantwortlich ist. Eine Mutation des Motivs an den Positionen D394 und E396 zu Alanin führte zur Retention des Kanals im perinukleären ER. Eine genauere Analyse der Signalsequenz zeigte, dass eine weitere saure Aminosäure (D392) Einfluss auf den ER Export des Kaliumkanals hat. Damit entspricht die Signalsequenz einem Motiv aus drei sauren Aminosäuren. Durch Patch Clamp Messungen konnte gezeigt werden, dass nur die Mutation aller drei saurer Aminosäuren zu vollständiger Inhibierung des ER Exports führt. Die elektrophysiologischen Untersuchungen belegen außerdem, dass das Ausmaß der Reduktion der K+ Leitfähigkeit von der Anzahl der mutierten sauren Aminosäuren abhängig ist. Mit Hilfe von FRET Messungen konnte die Bindung des Kaliumkanals KAT1 an die COPII Untereinheit Sec24 nachgewiesen werden, wobei die Interaktion von KAT1 mit Sec24 abhängig vom ER Exportmotiv war. Die Signalsequenz ist somit verantwortlich für die Rekrutierung des Kanals in COPII Vesikel und damit für den effizienten Export aus dem ER. Die Plasmamembranlokalisation der ER Exportmutante konnte in einem Rescue Experiment durch Heterotetramerisierung mit dem Wildtyp KAT1 wiederhergestellt werden. Dieses Rescue Experiment macht deutlich, dass nicht alle Untereinheiten in einem KAT1 Tetramer ein ER Exportmotiv tragen müssen, damit der Kanal an die Plasmamembran transportiert wird. ER Exportmotive sind somit in der Lage, nicht nur die Dichte sondern auch die Zusammensetzung von Kanälen in der Plasmamembran zu beeinflussen. Ein Vergleich des ER Exports von KAT1 in tierischen und pflanzlichen Zellen zeigt, dass der Mechanismus des ER Exports in eukaryotischen Zellen hoch konserviert ist.German
Uncontrolled Keywords: ER export, ion channel, plasma membrane localisation, plant, targeting, diacidic motif, KAT1, Sec24, COPII, trafficking
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
ER export, ion channel, plasma membrane localisation, plant, targeting, diacidic motif, KAT1, Sec24, COPII, traffickingEnglish
ER Export, Ionenkanal, Plasmamembran Lokalisation, Pflanze, KAT1, Sec24, COPII, SignalmotivGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 10 Mar 2009 11:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:55
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-13448
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Homann, PD Dr. Ulrike and Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Refereed: 23 January 2009
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/1344
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