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Elucidation of the molecular and cellular mechanisms of FKBP51-selective inhibitors

Haehle, Andreas (2020):
Elucidation of the molecular and cellular mechanisms of FKBP51-selective inhibitors.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00013235,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation Andreas Haehle V20200129.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Elucidation of the molecular and cellular mechanisms of FKBP51-selective inhibitors
Language: English
Abstract:

The FK506 Binding Protein 51 (FKBP51) is an identified risk factor for a variety of psychiatric disorders such as major depressive disorder as well as obesity and chronic pain. Enzymatically, FKBP51 exhibits prolyl-peptidyl-isomerase activity located within a pocket in its FK1 domain. The natural ligand and immunosuppressive drug FK506 binds to this pocket. Nowadays, several new classes of FKBP51 ligands have been developed. These compounds that lack the immunosuppressive feature, show higher affinity for FKBP51 and partial selectivity towards other FKBP family members. The Selective Antagonist of FKBP51 by Induced Fit 1 (SAFit1) is highly selective for FKBP51 compared to FKBP52, a close homolog and partial functional counterplayer of FKBP51. Ligands of the SAFit class have been shown to reverse FKBP51 induced inhibition of neurite development of neuronal cells and are active in various mouse models. Mice treated with SAFit2 have an improved stress coping behavior, remain leaner during a high-fat diet and show decreased symptoms in a chronic pain state. The best described molecular and cellular activity of FKBP51 is linked to the Glucocorticoid Receptor (GR), a key player in the stress signaling cascade. Mutations of the fkbp5 gene were linked to increased FKBP51 levels and glucocorticoid resistance. Beside the GR, FKBP51 has been described as the interactor of many other proteins e.g. within the NF-κB and Akt signaling pathway. Although FKBP51 is an attractive drug target of continuous rising interest, the underlying molecular and cellular functions of FKBP51 ligands and the protein itself remain to be elucidated. This thesis contributes in closing the gap between molecular biology and clinical findings regarding FKBP51 and its ligands. The first approach was the investigation of a new class of FKBP51 ligands developed by Tianqi Mao in the Hausch lab. These FKBP51 PROTACs (proteolysis targeting chimeras) aim to chemically knock down their target. These PROTACs were screened and a promising structure was identified, which resulted in decreased endogenous FKBP51 levels in cells detected through Western blotting. This finding was confirmed by a decreased FKBP51-Luciferase fusion protein signal and the PROTACs action in a GR reporter gene assay. The later assay supports the model of FKBP51 inhibiting and FKBP52 enhancing GR signaling. However, conventional ligands did not impact the FKBP51 effect. The second approach elucidated the interaction of FKBPs and the E3 ligase regulator Glomulin (Glmn) in detail. FKBP12.6 has been identified as novel interactor of this protein utilizing the HTRF (Homogeneous Time Resolved Fluorescence) methology. This is the first in-vitro assay, which addresses the binding of FKBP51 and a protein interactor on the molecular biological level. The amino acids F67 and D68 have been identified to be essential to establish the binding of Glmn to FKBP51s FK1 domain. At last, the FKBP51-Glmn complex is the first discovered interaction that is sensitive to multiple classes of FKBP51 ligands. In conclusion, my findings indicate two distinct modes of action of FKBP51. One is ligand-dependent and PPIase-domain-dependent while the other is independent. My thesis points out the importance to increase the focus on the investigation on defined FKBP51 interactions and to raise the efforts to develop FKBP51 ligands that address both FKBP51 action modi.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Das FK506-bindende Protein (FKBP51) wurde als Risikofaktor für diverse psychiatrische Erkrankungen wie bespielsweise Depression und andere Erkrankungen wie Fettleibigkeit und chronischem Schmerz identifiziert. FKBP51 ist enzymatisch aktiv, seine FK1-Domäne ist eine Prolyl-peptidyl-isomerase. FK506, ein natürlicher und immunsuppressiver Ligand, bindet an diese Tasche. Mittlerweile wurden verschiedene neue Klassen an FKBP51-Liganden entwickelt. Diese Moleküle sind nicht mehr immunsuppressiv, besitzen eine höhere Affinität zu FKBP51 und sind teilweise selektiv gegenüber anderen FKBPs. Der „Selective Antagonist of FKBP51 by Induced Fit 1“ (SAFit1) ist hochselektiv für FKBP51 gegenüber seinem engen Homolog und in Teilen funktionellem Gegenspieler FKBP52. Liganden mit SAFit-Struktur wirken dem Effekt von FKBP51 entgegen, die Ausdifferenzierung neuronaler Zellen zu inhibieren. Außerdem zeigen sie diverse Effekte in verschiedenen Mausmodellen. Mäuse, die mit SAFit2 behandelt werden, passen sich besser an Stress an, bleiben schlanker bei fetthaltiger Ernährung und weisen abgeschwächte Symptome bei chronischem Schmerz auf. Die am besten beschriebene Aktivität auf molekularer und zellulärer Ebene von FKBP51 wird mit dem Glucocorticoid Rezeptor (GR) assoziiiert. Dieser ist ein zentraler Regulator der Reizweiterleitung bei Stress. Mutationen im fkbp5-Gen wurden mit erhöhter FKBP51-Expression und Glucocorticoidresistenz assoziiert. Neben dem GR wurden noch viele weitere Proteine als FKBP51-Interaktoren beschrieben, u.a. innerhalb des NF-κB und Akt-Signalweges. Obwohl FKBP51 ein attraktives Drugtarget von stetig steigendem Interesse ist, sind die zugrundeliegenden molekularen und zellulären Funktion von FKBP51-Liganden und des Proteins selbst kaum aufgeklärt. Diese Dissertation trägt dazu bei, die Kluft zwischen Molekularbiologie und klinischen Befunden zu schließen. In einem ersten Ansatz wird die Erforschung einer neuen Klasse von FKBP51-Liganden, entwickelt von Tianqi Mao in der Arbeitsgruppe Hausch, beschrieben. Diese FKBP51-PROTACs (proteolysis targeting chimeras) sollen einen chemischen Knockdown ihres Targets bewirken. Die PROTACs wurden gescreent. Eine vielversprechende Struktur, die die Menge an zellulär endogenem FKBP51 heruntersetzt, wurde mittels Western Blotting identifiziert. Dieser Befund wurde sowohl durch die reduzierte Aktivität eines FKBP51-Luciferase-Konstrukts als auch durch die PROTAC-Wirkung in einem GR Reportergenassay bestätigt. Dieser Assay bestätigt zudem das Modell, dass FKBP51 den GR-Signalweg inhibiert und FKBP52 dem entgegenwirkt. Dennoch zeigten in diesem Assay konventionelle Liganden keinen Effekt. In einem zweiten Ansatz wurde die Interaktion von FKBPs und dem E3-Ligaseregulator Glomulin detailiert untersucht. FKBP12.6 wurde als neuer Bindepartner mittels HTRF-Methodik (Homogeneous Time Resolved Fluorescence) identifiziert. Dies ist der erste in-vitro-Assay, der die Bindung von FKBP51 an andere Proteine auf molekularbiologischer Ebene untersucht. Die Aminosäuren F67 und D68 sind essentiel, damit Glomulin an die FK1 Domäne von FKBP51 binden kann. Letztendlich beschreibt die Glomulin-FKBP51-Interaktion den allerersten Proteinkomplex, der sensitiv für verschiedene Klassen von FKBP51 Liganden ist. Zusammenfassend deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass FKBP51 zwei grundverschiedene Wirkungsweisen aufzeigt. Einer ist sensitiv für Liganden und abhängig von einer intakten PPIase-Domäne und der andere nicht. Diese Arbeit weist damit auf die Wichtigkeit der Erforschung definierter FKBP51-Protein-Interaktionen hin und unterstreicht das Ziel, Liganden zu entwickeln, die beide Wirkungsweisen von FKBP51 beeinflussen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 10 Aug 2020 13:22
Last Modified: 10 Aug 2020 13:35
DOI: 10.25534/tuprints-00013235
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-132350
Referees: Hausch, Prof. Dr. Felix and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Refereed: 14 October 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/13235
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