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Establishment of Fluorescence Assays for the Characterization of Site-Specific Proteases in E. coli

Ranglack, Jan (2020):
Establishment of Fluorescence Assays for the Characterization of Site-Specific Proteases in E. coli. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00012896,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Establishment of Fluorescence Assays for the Characterization of Site-Specific Proteases in E. coli
Language: English
Abstract:

Recent years have seen the increasing development and application of protease-based sensors and switches in the construction of artificial signaling functions in synthetic biology. Even though they were extensively characterized in vitro, robust and quantitative assays to characterize them in vivo remains elusive. This particularly concerns assays that can provide real-time kinetic data on the apparent activity of proteases and protease-based sensors and switches in the genetically-tractable E. coli and are compatible with high-throughput screening formats. Addressing these limitations, several different protease sensor designs featuring different types of fluorescent protein reporters were developed and tested over the course of the project. Protease-cleavable degradation tags (degrons) were identified as the best way to directly modulate the fluorescent output signal through proteolytic activity in E. coli. To this end, two different assay modes were successfully established: The first assay mode is based on a conventional positive read-out where the fluorescent signal scales proportionately with the protease activity while the second mode provides enhanced quantitative data based on a ratiometric two color assay. The assay was validated with the nuclear inclusion protein a (NIa) of tobacco vein mottling virus (TVMV) while the general utility of the assay was additionally validated with the NIa protease of tobacco etch virus (TEV) and the NS3 protein of hepatitis C virus (HCV). Finally, the assay was utilized for the preliminary screening of a library of opto-switchable auto-inhibited TVMV candidates.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

In den letzten Jahren wurden zunehmend Protease-basierte Sensoren und Schalter für die Konstruktion künstlicher Signalfunktionen in der synthetischen Biologie entwickelt und eingesetzt. Obwohl diese in vitro umfassend charakterisiert wurden, existieren nur wenige robuste und quantitative Assays zur Charakterisierung von Proteasen in vivo. Dies betrifft insbesondere Assays, die kinetische Echtzeitdaten zur apparenten Aktivität von Proteasen und Protease-basierten Sensoren und Schaltern unter Beibehaltung der Genotyp-Phänotyp-Kopplung in E. coli liefern können und mit Hochdurchsatz-Screeningformaten kompatibel sind. Um diesen Einschränkungen zu begegnen, wurden im Verlauf des Projekts verschiedene Protease-Sensordesigns mit verschiedenen Arten von fluoreszierenden Proteinreportern entwickelt und getestet. Protease-spaltbare Abbau-Tags (Degrons) wurden als der beste Weg identifiziert, um das fluoreszierende Ausgangssignal durch proteolytische Aktivität in E. coli direkt zu modulieren. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedene Testmodi erfolgreich etabliert: Der erste Testmodus basiert auf einer herkömmlichen positiven Auslesung, bei der das Fluoreszenzsignal proportional zur Proteaseaktivität ansteigt, während der zweite Modus verbesserte quantitative Daten basierend auf einem ratiometrischen Zweifarben-Assay liefert. Der Assay wurde mit dem nuclear inclusion protein a (NIa) des Tabakadernscheckungs-Virus (engl: tobacco vein mottling virus; kurz: TVMV) validiert, während der allgemeine Nutzen des Assays zusätzlich mit der NIa-Protease des Tabakätzvirus (TEV) und dem NS3-Protein des Hepatitis-C-Virus (HCV) validiert wurde. Schließlich wurde der Assay für das vorläufige Screening einer Bibliothek von optisch schaltbaren selbst-inhibierten TVMV-Kandidaten verwendet.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 253 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Protein Engineering of Ion Conducting Nanopores
Date Deposited: 16 Dec 2020 14:13
Last Modified: 17 Dec 2020 01:43
DOI: 10.25534/tuprints-00012896
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-128962
Referees: Stein, Prof. Dr. Viktor and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Refereed: 13 August 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/12896
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