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Die Rolle der Sphingosinkinase 2 in der Pathogenese gefäßproliferativer Netzhauterkrankungen

Eresch, Jeanette (2020):
Die Rolle der Sphingosinkinase 2 in der Pathogenese gefäßproliferativer Netzhauterkrankungen.
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00012225,
[Ph.D. Thesis]

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DissertationJeanetteEresch03.07.2020.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Die Rolle der Sphingosinkinase 2 in der Pathogenese gefäßproliferativer Netzhauterkrankungen
Language: German
Abstract:

Pathologisches Gefäßwachstum ist eine der Hauptursachen für Erblindung in ischämischen Retinopathien, eine diverse Gruppe von Erkrankungen, zu der auch die Frühgeborenenretinopathie (ROP) gehört, bei denen Gefäßverschlüsse oder Durchblutungsstörungen eine retinale Hypoxie mit Neovaskularisation (NV) verursachen. Der Hypoxie-induzierte vaskuläre endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) ist dabei nach derzeitigem Kenntnisstand der wichtigste angiogene Faktor. Daneben spielt auch der Signalweg über den Tyrosinkinase-Rezeptor 2 (Tie2) eine entscheidende angiogene Rolle. Dabei regulieren der Tie2 Ligand Angiopoietin 1 (Angp1) und der Antagonist Angiopoietin 2 (Angpt2) Gefäßstabilisierung und Destabilisierung, und agieren im Zusammenspiel mit VEGF. Sphingolipide sind neben ihrer Funktion als strukturelle Membrankomponenten auch als intra- und extrazelluläre Botenstoffe bekannt. Vor allem das bioaktive Sphingosin-1-Phosphat (S1P) reguliert eine Vielzahl zellulärer Prozesse, zu denen auch Proliferation, Zellüberleben und Angiogenese gehören. Es vermittelt seine biologischen Effekte über seine fünf Rezeptoren (S1PR1–5) und wird durch zwei ubiquitär exprimierte Sphingosinkinasen (Sphk) synthetisiert, die sich in ihren subzellulären Lokalisierungen und Gewebeexpressionen unterscheiden. Im retinalen Gefäßwachstum wurde in den letzten Jahren der S1P/S1PR1 Signalweg als wichtiger die Angiogenese inhibierender Signalweg etabliert, während eine Reduktion der Signaltransduktion Gefäßsprossung verstärkt. Damit ist das S1P generierende Enzym Sphk2, welches das prominentere in neuronalem Gewebe und damit auch der Retina ist, von großem Interesse und dessen Einfluss auf physiologische und pathologische Angiogenese war Hauptaugenmerk dieser Arbeit.

Dazu wurden im ersten Teil zwei gentechnisch veränderte Mauslinien in physiologischer Angiogenese untersucht. Die transgene Sphk2 (tgSphk2) Maus, bei der das zusätzliche Einschreiben des humanen Sphk2 Gens, eine systemische Sphk2 Überexpression erzeugt und die Sphk2 knockout (Sphk2-/-) Maus, bei der keine Expression der Sphk2 vorliegt. Allgemein zeigen die tgSphk2 Mäuse eine beschleunigte Angiogenese, bedingt durch einen S1P Gradienten mit im Gewebe erhöhten S1P Konzentrationen, ohne erhöhte VEGF-Expression. Die verringerte S1PR1-Expression zusammen mit den veränderten S1P Leveln deuten auf einen hyper-sprouting Phänotyp hin. Die Sphk2-/- Mäuse zeigten dagegen eine eher verlangsamte Angiogenese, erhöhte plasmatische S1P Konzentrationen, bedingt durch eine kompensatorische Regulierung der Sphk1 und dramatische Mangelexpression der vaskulären Wachstumsfaktoren und der Rezeptoren.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden diese gentechnisch veränderten Sphk2 Mäuse auf ihre pathologische Angiogenese untersucht. Dazu wurde das Sauerstoff-induzierte Retinopathie (OIR) Modell verwendet, welches die Symptomatik der ROP nachahmt. Hierzu wurden die Mäuse vom postnatalen Tag (P) 7 bis 12 in einer hyperoxischen Umgebung gehalten (75% O2), was zu Vaso-Obliteration (VO) und Regression bereits vorhandener Blutgefäße führt. Nach Rückkehr zur Raumluft entwickelte sich so eine relative Hypoxie in der Retina, welche NV induziert. Bei den tgSphk2 Mäusen zeigte sich eine geringere VO und eine frühere und stärker ausgeprägte NV mit chaotischer Morphologie des Blutgefäßnetzwerkes. Dies ist einerseits auf den hyper-sprouting Phänotyp zurückführen, aber auch auf die zu Beginn der hypoxischen Phase erhöhten S1PR3-Expression, was zur Aktivierung von VEGF-R und damit dessen angiogenem Signalweg beiträgt, auch wenn die VEGF-Expression im Gegensatz zu Wildtyp Tieren im Zuge des OIR Modells nicht ansteigt. Ebenso begünstigt die sinkende Angpt1-Expression Gefäßsprossung, gepaart mit dem NV-induzierenden Zusammenwirken von VEGF und Angpt2. Der dadurch vorliegende angiogene Phänotyp der tgSphk2 Mäuse artet unter diesen pathologischen Bedingungen aus und führt zu unkontrolliertem und chaotischem Gefäßwachstum. Dagegen zeigten die Sphk2-/- Tiere keine Veränderung in der VO, aber eine deutlich verlangsamte und gestörte NV mit auffälliger Mangelexpression sowohl in den Rezeptoren als auch in vaskulären Wachstumsfaktoren. Die Expression von S1PR1 stieg zwar in diesen Mäusen zum letzten Beobachtungstag hin an, was jedoch zu einer Inhibition des VEGFR Signalisierung führt, die eventuell auf eine Rezeptortransaktivierung durch die hohen plasmatischen S1P-Level zurückzuführen ist, da VEGF selbst in diesen Mäusen kaum exprimiert wird. Allgemein könnte der Mangel aller wichtigen Faktoren, die die Bildung neuer Blutgefäße regulieren, wie VEGF, Angpt1, Angpt2 und die S1PRs, zu den spärlich und fehlerhaft gebildeten Gefäßen führen, die bei diesen Mäusen im Krankheitsmodell aufgefunden wurden.

In der vorliegenden Arbeit konnte ein bedeutender Einfluss des S1P produzierenden Enzyms Sphk2 auf physiologische und pathologische Angiogenese gezeigt werden, was die wichtige Rolle der Sphk2/S1P/S1PRs Achse unterstreicht und die pleiotropen Effekte von S1P hervorhebt. Global betrachtet bewirkte ein Übermaß an Sphk2 ein Ausarten des Blutgefäßwachstums, während ein Mangel an Sphk2 zu spärlichem und fehlerhaften Blutgefäßwachstum führte. Demensprechend könnte ein Zeitpunkt spezifisches Eingreifen in die Sphk2/S1P/S1PR Achse mittels pharmakologischer Inhibitoren ein vielversprechender Angriffspunkt zur therapeutischen Behandlung von gefäßproliferativen Netzhauterkrankungen, wie der ROP, darstellen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Pathological blood vessel growth is a major cause of blindness in ischemic retinopathies, a diverse group of retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), in which ischemia or vessel occlusion leads to retinal hypoxia and neovascularization (NV). The hypoxia-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) is the predominant growth factor associated with pathological angiogenesis. Other important angiogenic factors are angiopoietin 1 (Angpt1) and angiopoietin 2 (Angpt2) with their tyrosine kinase receptor 2 (Tie2). Angpt1/Tie1 binding stimulates vessel stabilization, while Angpt2 acts as an antagonist, leading to vessel destabilization and act in concert with VEGF. Sphingolipids are structural membrane components which also act as intra- and extracellular messengers. Especially, the bioactive sphingosine-1-phosphate (S1P) is known for its regulation of various cellular process, such as proliferation, cell survival and angiogenesis. S1P mainly exerts its biological effects via five receptors (S1PR1-5) and is catalysed by two ubiquitous expressed sphingosine kinases (Sphk1 and Sphk2), which differ in their subcellular localisations and tissue expressions. Recent studies established the S1P/S1PR1 signalling pathway as a prominent signal for inhibition of angiogenesis and a reduction of the signal transduction increases vessel sprouting. Therefore, the S1P catalysing enzyme Sphk2, the prominent isoform in neuronal and retinal tissue, is of great interest and its role in physiological and pathological angiogenesis is the main focus of this study. For this purpose, two genetically modulated mouse strains were used in the first part of the study. A transgene Sphk2 (tgSphk2) mouse, in which the knockin of the human Sphk2 gene leads to a systemic overexpression of Sphk2, and a Sphk2 knockout (Sphk2-/-) mouse, with a deficient Sphk2 expression. In tgSphk2 mice, an accelerated retinal angiogenesis, based on an S1P gradient with increased S1P concentration in the tissue, without further increased VEGF expression, was found. The reduction in S1PR1 expression together with the change in S1P levels suggest a hyper-sprouting phenotype. In contrast, angiogenesis was slowed down in the Sphk2-/- mice, with increased plasmatic S1P concentrations, due to a compensatory regulation of Sphk1 and dramatic deficiency in the expression of the vascular growth factors and receptors. In the second part of the study, pathological angiogenesis was analysed in the genetically modified Sphk2 mice, for which the oxygen-induced retinopathy (OIR) model, mimicking the symptoms of ROP, was used. From postnatal (P) day 7 to 12 mice were held in hyperoxia (75% O2), leading to vaso-obliteration (VO) and regression of already established blood vessels. Upon returning to room air, the retina develops relative hypoxia, which induces NV. In tgSphk2 mice VO was reduced and NV occurred faster and stronger but with a morphologically chaotic vessel system. This could be not only because of the hyper-sprouting phenotype, but also because of the initial upregulation of S1PR3 expression, leading to the activation of VEGFR and its angiogenic signalling pathway, even without a further increase in VEGF expression compared to the wildtype mice during the course of the OIR model. Furthermore, the decreasing Angpt1 expression benefits vessel sprouting and Angpt2 in cooperation with VEGF promotes NV. This angiogenic phenotype of the tgSphk2 mice leads to accelerated and chaotic blood vessel growth under pathological conditions. In contrast, the Sphk2-/- mice showed no change in VO, but a significantly decelerated and disrupted NV with deficient expression of receptors as well as vascular growth factors. The higher plasmatic S1P level in these mice could lead to a VEGFR receptor transactivation, as VEGF itself is hardly expressed in these mice. But the increase in S1PR1 expression at the last observation day would lead in turn to an inhibition of the VEGFR signalling. The dramatic deficiency in the expression of all angiogenic factors like VEGF, Angpt1, Angpt2 and the S1PRs, may explain the severely defective vessel regrowth found in these mice in the OIR model. In the present study, the major impact of the S1P producing enzyme Sphk2 in physiological and pathological angiogenesis was demonstrated, emphasizing the important role of the Sphk2/S1P/S1PRs axis and highlighting the pleiotropic effects of S1P. In general, an overexpression of Sphk2 leads to an accelerated but chaotic blood vessel growth, while Sphk2 deficiency caused sparse and defective blood vessel growth. Therefore, a stage-specific inhibition of the Sphk2/S1P/S1PR axis may offer attractive novel targets and therapeutic potential to treat ischemic retinal diseases, such as ROP.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 22 Jul 2020 08:40
Last Modified: 22 Jul 2020 12:30
DOI: 10.25534/tuprints-00012225
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-122253
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Pfeilschifter, Prof. Dr. Waltraud
Refereed: 3 July 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/12225
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