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In vivo und in vitro Interaktionen haloarchaealer Gasvesikelproteine

Völkner, Kerstin (2020):
In vivo und in vitro Interaktionen haloarchaealer Gasvesikelproteine.
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.25534/tuprints-00011850,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation Kerstin Völkner 2020.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: In vivo und in vitro Interaktionen haloarchaealer Gasvesikelproteine
Language: German
Abstract:

Die p-vac Region aus Hbt. salinarum PHH1 besteht aus zwei entgegengesetzt orientierten Genclustern, gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM, deren Expression zur Bildung von Gasvesikeln führt. Jedes dieser Gene kodiert für ein Gasvesikelprotein (Gvp). GvpA ist das Hauptstrukturprotein der Gasvesikelhülle und GvpC stabilisiert diese. Den Proteinen GvpD und GvpE wird eine regulatorische Rolle zugesprochen. Dabei fungiert GvpE als Transkriptionsaktivator und GvpD als -repressor. Die Proteine GvpFGHIJKLM sind hingegen akzessorische Proteine, die in einem frühen Stadium der Gasvesikelbildung in geringer Menge gebildet werden. Möglicherweise sind die meisten der akzessorischen Gasvesikelproteine in der Gasvesikelstruktur integriert, da alle, bis auf GvpK, in einer Gasvesikelpräparation nachgewiesen werden konnten. Auch sind sie, bis auf GvpH und GvpI, essentiell für die Bildung eines gasgefüllten Vesikels. In vergangenen Arbeiten wurde gezeigt, dass GvpM mit GvpH, GvpL oder GvpJ interagiert. Eine Interaktion von GvpM mit GvpG konnte nicht nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen wurden in vitro mit heterolog in E. coli produzierten HisGvp-Fusionsproteinen unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die von Tavlaridou et al. begonnenen Interaktionsstudien fortgeführt. Bei der Reinigung der HisGvp-Fusionsproteine zeigten sich eine Vielzahl von Co-Präzipitaten in den Coomassie-Färbungen. Bei der Durchführung der Pulldown-Assays und anschließenden Western-Analysen wurden darüber hinaus Kreuzreaktionen der verwendeten Gvp-Antiseren gegenüber den HisGvp-Fusionsproteinen festgestellt. Aus diesem Grund konnten keine eindeutige Aussage über Interaktionen getroffen werden. Daher wurde eine Methode etabliert, die den Nachweis von Protein-Protein Interaktionen unter nativen Bedingungen ermöglicht. Hierfür wurde die Cellulose-Bindedomäne (CBD) aus Clostridium thermocellum verwendet, da diese auch unter Hochsalzbedingungen stabil ist. Mit Hilfe dieser ist es nun erstmals möglich, Gasvesikelproteine in hoher Reinheit, ohne die Co-Präzipitation von Kontaminanten, zu isolieren. Zum Nachweis der Protein-Protein Interaktionen wurden die CBDGvp-Fusionsproteine gemeinsam mit dem putativen Interaktionspartner in Hfx. volcanii synthetisiert und das Gesamtzelllysat über eine Cellulosematrix gereinigt. Die Ergebnisse der Western-Analysen zeigten, dass alle akzessorischen Gasvesikelproteine miteinander interagieren. Lediglich der Interaktionsnachweis von GvpL mit GvpH oder GvpI war uneindeutig. Diese Ergebnisse verifizieren die Ergebnisse von Tavlaridou et al. und zeigen zudem eine Interaktion zwischen GvpG und GvpM. Darüber hinaus wurde die CBD-Methode zum Nachweis eines putativen Proteinkomplexes aus all diesen Gvp-Proteinen verwendet. Dazu wurde GvpM mit der CBD fusioniert und zusammen mit den sieben akzessorischen Gasvesikelproteinen GvpF, GvpG, GvpH, GvpI, GvpJ, GvpK und GvpL in Hfx. volcanii co-synthetisiert. Dabei fungierte CBDM als bait (Räuber) Protein und die Proteine GvpF bis GvpL als prey (Beute) Proteine. Die Western-Analysen des Pulldown-Assays zeigten, dass alle akzessorischen Gasvesikelproteine mit CBDM isoliert werden konnten. Dieses Ergebnis deutet daraufhin, dass die akzessorischen Gasvesikelproteine möglicherweise einen oder mehrere Proteinkomplexe bilden können. Zusätzlich wurden die Protein-Protein Interaktionen der akzessorischen Gasvesikelproteine und GvpA direkt in vivo mittels split-GFP untersucht. Die Methode beruht auf dem Prinzip, dass das salzstabile und modifizierte grün fluoreszierende Protein mGFP2 in zwei Teile zerlegt und die resultierenden Fragmente NGFP und CGFP jeweils an die putativen Interaktionspartner fusioniert wurden. Interagieren die beiden fusionierten Proteine (und gibt es keine sterischen Behinderungen), können beide GFP-Teile zu einem funktionalen Protein assemblieren. Die Interaktionsstärke kann schließlich über die relative Fluoreszenz (rf) ermittelt werden. Mit Hilfe dieser Methode konnten viele Interaktionen bestätigt und ein erstes Interaktionsnetzwerk der akzessorischen Gasvesikelproteine erstellt werden. Zudem zeigte sich, dass GvpA nur mit GvpF interagiert und dass GvpL womöglich eine zentrale Rolle im Proteinkomplex der akzessorischen Gasvesikelproteine spielt. Darüber hinaus wurden die Interaktionsstellen in GvpM zu anderen Gvp-Proteinen näher definiert. Dazu wurden GvpM-Fragmente verwendet, die den N-terminalen Bereich (M25N) und den C-terminalen Bereich (M25C) repräsentieren und jeweils auf Interaktion mit den Proteinen GvpF bis GvpL hin untersucht. M25N interagierte hauptsächlich mit GvpI und GvpL und M25C hauptsächlich mit GvpF, GvpG, GvpH, GvpJ oder GvpK. Auch wurden bereits vorhandene GvpM-Deletionsvarianten auf Interaktion mit GvpF und GvpL untersucht, die ebenfalls zeigten, dass der N-terminale Bereich von GvpM wichtig für die L/M-Interaktion ist, während der C-terminale Bereich wichtig für die F/M-Interaktion ist. Um die Interaktionsstellen auf einzelne Aminosäuren eingrenzen zu können, wurden GvpM-Varianten hergestellt und sowohl auf Gasvesikelbildung als auch auf Interaktionsfähigkeit mit GvpL untersucht. Durch den Vergleich der Auswirkung auf die Gasvesikelbildung und der Interaktionsfähigkeit mit GvpL wurden zwei Motive in GvpM identifiziert, die für die L/M-Interaktion von Bedeutung sind: das PETI-Motiv in der putativen α-Helix 1, und das GAV/RAAIA-Motiv in den loops zwischen α-Helix 1 und β-Faltblatt 1 und zwischen dem β-Faltblatt 2 und der α-Helix 2. Aminosäuresubstitutionen in diesem Bereich haben in den meisten Fällen sowohl einen negativen Effekt auf die Gasvesikelbildung als auch einen positiven Effekt auf die L/M-Interaktion. Offenbar hat eine verstärke L/M-Interaktion einen negativen Einfluss auf die Gasvesikelbildung.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The p-vac region of Hbt. salinarum PHH1 consists of two oppositely oriented gene clusters, gvpACNO and gvpDEFGHIJKLM, whose expression leads to the formation of gas vesicles. Each of these genes encodes a gas vesicle protein (Gvp). GvpA is the main structural protein of the gas vesicle envelope and GvpC stabilizes it. The proteins GvpD and GvpE are assigned a regulatory role. GvpE acts as a transcription activator and GvpD as a repressor. The proteins GvpFGHIJKLM are accessory proteins that are produced in small quantities in the early stages of gas vesicle formation. It is possible that most of the accessory gas vesicle proteins are integrated in the gas vesicle structure, since all but GvpK could be detected in a gas vesicle preparation. Except for GvpH and GvpI, they are also essential for the formation of a gas-filled vesicle. Past work has shown that GvpM interacts with GvpH, GvpL or GvpJ. An interaction of GvpM with GvpG could not be demonstrated. These investigations were performed in vitro with HisGvp fusion proteins produced heterologously in E. coli under denaturing conditions. Within the framework of this work, the interaction studies started by Tavlaridou et al. were continued. During the purification of the HisGvp fusion proteins a large number of co-precipitates were found in the Coomassie stains. In addition, during the performance of the pull-down assays and subsequent Western analyses, cross-reactions of the Gvp antisera used to the HisGvp fusion proteins were detected. For this reason, no clear statement about interactions could be made. Therefore, a method was established which allows the detection of protein-protein interactions under native conditions. For this purpose, the cellulose binding domain (CBD) from Clostridium thermocellum was used, as it is stable even under high salt conditions. With the help of this it is now possible for the first time to isolate gas vesicle proteins in high purity without the co-precipitation of contaminants. To detect protein-protein interactions, the CBDGvp fusion proteins were synthesized together with the putative interaction partner in Hfx. volcanii and the total cell lysate was purified via a cellulose matrix. The results of the Western analyses showed that all accessory gas vesicle proteins interact with each other. Only the proof of interaction of GvpL with GvpH or GvpI was inconclusive. These results verify the results of Tavlaridou et al. and also show an interaction between GvpG and GvpM. Furthermore, the CBD method was used to detect a putative protein complex from all these Gvp proteins. For this purpose, GvpM was fused with the CBD and co-synthesized together with the seven accessory gas vesicle proteins GvpF, GvpG, GvpH, GvpI, GvpJ, GvpK and GvpL in Hfx. volcanii. CBDM acted as bait protein and the proteins GvpF to GvpL as prey proteins. Western analyses of the pull-down assay showed that all accessory gas vesicle proteins could be isolated with CBDM. This result suggests that the accessory gas vesicle proteins may possibly form one or more protein complexes. In addition, the protein-protein interactions of the accessory gas vesicle proteins and GvpA were investigated directly in vivo using split-GFP. The method is based on the principle that the salt-stable and modified green fluorescent protein mGFP2 was split into two parts and the resulting fragments NGFP and CGFP were each fused to the putative interaction partners. If the two fused proteins interact (and if there are no steric hindrances), both GFP parts can be assembled into a functional protein. Finally, the strength of interaction can be determined by the relative fluorescence (rf). With the help of this method many interactions could be confirmed and a first interaction network of the accessory gas vesicle proteins could be established. Furthermore, it was shown that GvpA interacts only with GvpF and that GvpL possibly plays a central role in the protein complex of the accessory gas vesicle proteins. In addition, the interaction sites in GvpM with other Gvp proteins were defined in more detail. For this purpose, GvpM fragments were used that cover the N-terminal region (M25N) and the C-terminal region (M25C) and examined for interaction with the proteins GvpF to GvpL. M25N mainly interacted with GvpI and GvpL and M25C mainly with GvpF, GvpG, GvpH, GvpJ or GvpK. Existing GvpM deletion variants were also examined for interaction with GvpF and GvpL, which also showed that the N-terminal region of GvpM is important for L/M interaction, while the C-terminal region is important for F/M interaction. In order to narrow down the interaction sites to single amino acids, GvpM variants were prepared and investigated for gas vesicle formation as well as for their ability to interact with GvpL. By comparing the effect on gas vesicle formation and the ability to interact with GvpL, two motifs in GvpM were identified that are important for L/M interaction: the PETI motif in the putative α helix 1, and the GAV/RAAIA motif in the loops between α helix 1 and β leaflet 1 and between β leaflet 2 and α helix 2. Amino acid substitutions in this region have in most cases both a negative effect on gas vesicle formation and a positive effect on L/M interaction. Apparently, an enhanced L/M interaction has a negative effect on gas vesicle formation.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Microbiology and Archaea
Date Deposited: 09 Sep 2020 14:43
Last Modified: 09 Sep 2020 14:43
DOI: 10.25534/tuprints-00011850
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-118501
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kletzin, PD Dr. Arnulf
Refereed: 7 August 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/11850
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