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Systematic Analyses of structure/function variability of viral K+ channels for the development of synthetic channels

Kukovetz, Kerri (2020):
Systematic Analyses of structure/function variability of viral K+ channels for the development of synthetic channels.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00011813,
[Ph.D. Thesis]

Available under CC-BY-SA 4.0 International - Creative Commons, Attribution Share-alike.

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Systematic Analyses of structure/function variability of viral K+ channels for the development of synthetic channels
Language: English

Potassium (K+) channels are an important class of ion channels, which serve crucial physiological functions. All known K+ channels have a similar architecture: a central ion-conducting pore, with a high similarity throughout all different forms of life, eukaryotes, archaea, bacteria and even in viruses. The latter turns out to be a very interesting group: K+ channels isolated from viruses are reduced to an absolute minimum, basically representing the pore module of every K+ channel. Despite their minimall size, they still possess many of the essential and characteristic properties of bigger and more complex channels. This makes them an ideal model system to investigate structure/function correlations that determine ion permeation and gating in K+ channels. In this study, the planar lipid bilayer (PLB) method was used to analyze small viral K+ channels on the single channel level. This reduced electrophysiological measuring system allows a quick and easy modification of the experimental conditions such as pH, ion concentration or lipid environment, as well as a straight forward addition of blockers. In the first part, a novel technique for a fast and artifact-free functional analysis is introduced. We show that adding nanodiscs to an in vitro expression system results in a time-saving and contamination-free method for expression and purification of membrane proteins, which can subsequently be used for single channel analyses with different methods. The viral potassium channel KcvNTS, as well as the model bacterial channel KcsA could successfully be reconstituted into PLBs after expression in the presence of nanodiscs. The experiments also show that not the lipid from nanodisc determines channel function, but the lipid composition of the target membrane in which the channel of interest later incorporates into. The data also show that this technique could be used for the functional reconstitution of the synthetic blue light sensitive channel BLINK1. Unlike expression in cells, in PLBs this channel loses its light sensitivity, which demonstrates a shortcoming of the method regarding posttranslational modifications. The second part of the study is dedicated to the systematic analyses of the small viral K+ channel KcvPBCV-1. A subunit consists of 94 amino acids, which contains two transmembrane (TM) helices, a pore loop including the selectivity filter and a short N-terminal helix. Previous studies with yeast complementation assays have shown that leucine at position 94 plays a crucial role in channel gating. In this preceding study, leucine was exchanged to all other proteinogenic amino acids and the degree of yeast complementation was monitored as an indirect parameter for channel activity. Here, KcvPBCV-1 and the 19 mutants KcvPBCV-1 L94X were analyzed on the single channel level, to determine the effect of each mutation on the key functional parameters of channel function: unitary single channel conductance and open probability. The single channel analyses are not compatible with the yeast complementation assays. This means that the latter method is suitable for screening of basal channel function but provides no information on detailed functional features of a channel. The results of the yeast complementation assays are presumably also influenced by secondary factors such as sorting and translation efficiency of the channel protein. Nonetheless, the single channel data demonstrate that the last amino acid of KcvPBCV-1 has a complex impact on channel function and can modulate the open probability as well as the unitary single channel conductance. The main observations are that KcvPBCV-1 L94P and KcvPBCV-1 L94C have both, an increasing 2 impact on the channels open probability and voltage dependency. Another discovery was that introduction of an amino acid with a basic side chain inverts the voltage dependency of the open probability and reduces the unitary single channel conductance of KcvPBCV-1. Since the amino acid histidine can be titrated in the physiological pH range, KcvPBCV-1 and KcvPBCV-1 L94H were examined within a pH window from 4 to 9. It turns out that the wild type channel already exhibits a mild sensitivity toward H+, which is strongly increased by mutation of L94H. This histidine associated effect is described with a simple two-state model, where KcvPBCV-1 L94H can pass from a state of high conductance (Gmax) to a state of low conductance (Gmin) either via an effect which is inherent to the wild type protein or via an effect which is introduced by the mutation to histidine. Fitting the results based on this model shows that the effect after mutation of L94H completely masks the effect that H+ has on the wild type channel. Further, the effect during the transition from deprotonated to protonated histidine (pH 6) can be mimicked, by addition of NiCl2 to the bath solution during measurements of KcvPBCV-1 L94H at low H+ concentrations. Deprotonated histidine is known to coordinate Ni2+. However, the complexity of this H+ dependency does not allow to use this as a sensor system for pH. In the last part of the study two additional small viral K+ channels, KcvGNLD and KcvMT325 were examined in PLBs. So far both channels have only been characterized on a macroscopic level either by patch clamp measurements in HEK293 cells or with two-electrode voltage clamp measurements in oocytes. The two channels differ slightly in their aligned amino acid sequence but are quite similar in respect to conductance and open probability. The open probability is voltage-dependent, decreasing from 100% to ~10% with positive voltages. With increasing K+ concentrations the voltage-dependent decrease of the open probability is shifted towards more positive voltages. Also, KcvGNLD and KcvMT325 both possess a threonine in the selectivity filter directly before the GY/FG motive, compared to most other Kcv channels which possess a valine at this position. Mutation of threonine to valine results in a loss of the voltage dependency in both, KcvGNLD and KcvMT325, despite the similarity of the two amino acids. The results of the different experiments demonstrate that for small viral K+ channels modification of basic channel properties such as an inversion or loss of voltage dependency, alteration of unitary single channel conductance or open probability can easily be achieved by mutation of only a single amino acid. This feature makes viral K+ channels particularly suitable modules for the construction of synthetic channels. With only little effort, great differences in the phenotype of single channel properties can be achieved.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Kaliumkanäle sind eine wichtige Gruppe von Ionenkanälen, die wesentliche physiologische Funktionen erfüllen. Alle bekannten K+ Kanäle haben eine ähnliche Architektur mit einer zentralen, leitenden Pore, die eine hohe Ähnlichkeit in allen bekannten Lebensformen, Eukaryonten, Archaeen, Bakterien und sogar Viren aufweist. Letztere erweisen sich als eine äußerst Interessante Gruppe, da die aus Viren isolierten K+ Kanäle auf ein absolutes Minimum reduziert sind und im Grunde das Porenmodul von allen K+ Kanälen repräsentieren. Trotz ihrer reduzierten Größe besitzen sie alle wesentlichen charakteristischen Eigenschaften von größeren, komplexeren K+ Kanälen, was sie zu einem idealen Modellsystem zur Untersuchung von Struktur/Funktionsbeziehungen macht, welche die Permeabilität von Ionen und das gating der Kanäle bestimmt. In dieser Arbeit wurde die planare Lipid bilayer (PLB) Technik verwendet um kleine, virale K+ Kanäle auf Einzelkanalebene elektrophysiologisch zu untersuchen. Mit diesem auf das Wesentliche reduzierte Messsystem ist eine schnelle und einfache Änderung der experimentellen Bedingungen, wie pH, Ionenkonzentration oder Lipidzusammensetzung, möglich, so wie das unkomplizierte Hinzugeben von Blockern. Im ersten Teil wird eine neue Methode zur Funktionsanalyse von Membranproteinen vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von nanodiscs zu einem in vitro Expressionssystem in einer zeitsparenden und kontaminationsfreien Methode resultiert, um Membranproteine zu exprimieren und aufzureinigen, damit sie anschließend mit verschiedenen Methoden für Einzelkanalmessungen verwendet werden können. Der virale K+ Kanal KcvNTS und der häufig als Modell verwendete, bakterielle K+ Kanal KcsA konnten erfolgreich nach Expression in Anwesenheit von nanodics mit der PLB Methode untersucht werden. Die Experimente haben außerdem ergeben, dass nicht die Lipide innerhalb der nanodiscs die Kanaleigenschaften bestimmen, sondern die Lipidzusammensetzung der Zielmembran innerhalb des Versuchsaufbaus. Die Daten zeigen ebenfalls, dass diese Methode für den synthetischen, durch Blaulicht aktivierten K+ Kanal BLINK1 erfolgreich angewendet werden konnte. Im Gegensatz zur Expression in Zellen verliert BLINK1 jedoch seine Lichtempfindlichkeit, was ein Defizit der Methode hinsichtlich posttranslationaler Modifikationen darstellt. Im zweiten Teil geht es um die systematische Analyse des viralen K+ Kanals KcvPBCV-1. Eine Untereinheit besteht aus 94 Aminosäuren, welche zwei Transmembran (TM) Helices, eine Porenschleife mit dem Selektivitätsfilter und eine kurze N-terminale Helix ausbildet. Vorangehende Studien mit Hefekomplementationsassays haben ergeben, dass die Position 94 in KcvPBCV-1 eine wichtige Rolle beim gating spielt. In diesen vorherigen Versuchen wurde Leucin durch alle weiteren proteinogenen Aminosäuren ausgetauscht und das Maß der Hefekomplementation als indirekter Parameter für Kanalaktivität festgestellt. In dieser Arbeit wurde KcvPBCV-1 und die 19 Mutanten KcvPBCV-1 L94X auf Einzelkanalebene analysiert um den Effekt jeder einzelnen Mutation auf die wichtigsten Kanaleigenschaften, Einzelkanalleitfähigkeit und Offenwahrscheinlichkeit, zu überprüfen. Die Ergebnisse der PLB Messungen sind nicht kompatibel mit denen der Hefekomplementationsassays. Das bedeutet, dass letzteres eine geeignete Methode ist um die grundlegende Kanalfunktion zu überprüfen, jedoch wird keine Information über detaillierte Kanaleigenschaften geliefert. Die Ergebnisse der 4 Hefekomplementationsassays sind vermutlich auch durch sekundäre Faktoren, wie Sortierung und Translationseffizient des Kanalproteins beeinflusst. Dennoch zeigen die Ergebnisse der Einzelkanalmessungen, dass die letzte Aminosäure von KcvPBCV-1 eine komplexe Auswirkung auf die Kanalfunktion hat und sowohl Einfluss auf die Offenwahrscheinlichkeit, als auch die Einzelkanalleitfähigkeit nimmt. Die wichtigsten Beobachtungen nach Messung der Mutanten waren, dass KcvPBCV-1 L94P und KcvPBCV-1 L94C zu einer Erhöhung der durchschnittlichen Offenwahrscheinlichkeit, so wie der Spannungsabhängigkeit führen. Ein weiteres Ergebnis war, dass nach Mutation zu Aminosäuren mit basischen Seitenketten zum einen die Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit invertiert und zum anderen die Einzelkanalleitfähigkeit im Vergleich zum Wild Typ deutlich reduziert ist. Aufgrund der Titrierbarkeit von Histidin wurden sowohl KcvPBCV-1, also auch die Mutante KcvPBCV-1 L94H im pH Bereich zwischen 4 und 9 auf ihre H+ Sensitivität untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass bereits der Wild Typ eine H+ Sensitivität aufweist, die durch Mutation von L94H deutlich verstärkt wird. Um den mit Histidin zusammenhängenden Effekt zu beschreiben wurde ein einfaches Zwei-Zustandsmodell angewendet, in welchem sich der Kanal in einem Zustand mit hoher Leitfähigkeit (Gmax) oder niedriger Leitfähigkeit (Gmin) befinden kann. Der Übergang von einem Zustand in den anderen kann über zwei Wege erfolgen, entweder durch den Effekt der mit dem Wild Typ einhergeht, oder durch den Effekt der durch die Mutation L94H ausgelöst wird. Werden die Daten basierend auf diesem Modell gefittet, ergibt sich, dass der Effekt durch die Mutation L94H den des Wild Typs komplett überschreibt. Außerdem konnte der Effekt der im Übergangsbereich von deprotoniertem zu protoniertem Histidin (pH 6) auftritt durch Zugabe von NiCl2 zur Elektrolytlösung während der Messung von KcvPBCV-1 L94H bei niedrigen H+ Konzentrationen imitiert werden. Ni2+ ist dafür bekannt, mit deprotoniertem Histidin zu komplexieren. Die Komplexität dieser H+ Abhängigkeit erlaubt es jedoch nicht daraus auf eine pH Sensorik zu schließen. Im letzten Teil der Arbeit werden zwei weitere virale K+ Kanäle, KcvGNLD und KcvMT325 mit der PLB Methode untersucht. Bisher wurden die Kanäle erst anhand von patch clamp Messungen in HEK293 Zellen oder mit der two-electrode voltage clamp Technik in Xenopus Oozyten untersucht. Die beiden Kanäle unterscheiden sich zwar geringfügig in ihrer Aminosäuresequenz, zeigen aber sehr ähnliche Eigenschaften in Bezug auf Einzelkanalleitfähigkeit und Offenwahrscheinlichkeit. Die Offenwahrscheinlichkeit beider Kanäle ist spannungsabhängig und nimmt von nahezu 100% auf ~10% ab mit höheren positiven Spannungen. Eine Erhöhung der K+ Konzentration führt zu einer Verschiebung der Spannungsabhänigkeit in Richtung positiver Spannungen. Außerdem weisen beide Kanäle innerhalb des Selektivitätsfilters ein Threonin an der Position unmittelbar vor dem GY/FG Motiv auf, im Vergleich zu den Meisten anderen Kcv Kanälen, welche an dieser Position ein Valin besitzen. Die Substitution von Threonin zu Valin führt trotz der Ähnlichkeit der beiden Aminosäuren sowohl in KcvGNLD als auch in KcvMT325 zu einem Verlust der Spannungsabhängikeit. Die Ergebnisse der verschiedenen Experimente zeigen, dass bei viralen K+ Kanälen bereits durch einzelne Mutationen die grundlegenden Kanaleigenschaften wie Spannungsabhängigkeit, Offenwahrscheinlichkeit und Einzelkanalleitfähigkeit stark verändert werden können. Diese Eigenschaft macht virale K+ Kanäle zu einem besonders geeigneten Baustein zur Herstellung synthetischer Kanäle. Mit nur geringem Aufwand können große Unterschiede auf der Einzelkanalebene erreicht werden.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
10 Department of Biology > Protein Engineering of Ion Conducting Nanopores
Date Deposited: 02 Sep 2020 12:44
Last Modified: 02 Sep 2020 14:58
DOI: 10.25534/tuprints-00011813
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-118130
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Schröder, Dr. Indra
Refereed: 29 July 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/11813
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