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Untersuchung von Peptidomimetika als Inhibitoren für das Chemokin CXCL8

Brahm, Kevin (2020):
Untersuchung von Peptidomimetika als Inhibitoren für das Chemokin CXCL8.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00011794,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchung von Peptidomimetika als Inhibitoren für das Chemokin CXCL8
Language: German
Abstract:

Als kleine Signalmoleküle des Immunsystems spielen Chemokine eine essentielle Rolle bei einer Vielzahl von chronisch entzündlichen Krankheiten und Autoimmunerkrankungen. Die Inhibition der Wechselwirkung dieser Moleküle mit ihren korrespondierenden Rezeptoren ist daher eine wichtige Strategie in der Entwicklung neuer Pharmazeutika zur Therapie dieser Entzündungserkrankungen. Ein Ansatz zur Chemokininhibition sind Peptide, die von diesen Rezeptoren abgeleitet werden und damit die Protein-Rezeptor-Wechselwirkung nachahmen und inhibieren können. In vorangeganenen Arbeiten wurde mit Hilfe von molekularem Modeling ein Peptid entwickelt, das einen Teil der Bindungsstelle des CXCL8 Rezeptors CXCR1 nachahmt. Dieses Peptid, IL8RPLoops, besteht aus zwei verknüpften Sequenzen aus der zweiten und dritten extrazellulären Schleife der Rezeptors, die ausreichend lang sind, um jeweils eine helikale Windung auszubilden. Es bindet mit submikromolarer Affinität an das Chemokin CXCL8. Wir vermuteten, dass die Vororientierung dieses Peptids in Lösung zu einer Rezeptor-ähnlichen Konformation für die relativ hohe Bindungsaffinität des linearen Peptids verantwortlich ist. Weitere Untersuchungen ergaben, dass am C-terminalen Ende des Peptids Glutaminsäure, statt Glutamin inkorporiert wurde und dieser durch Desamidierung hervorgerufene Austausch die Ausbildung sekundärer Strukturen des freien Peptids begünstigte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde daher die Auswirkung bestimmter Sekundärstrukturelemente des aus CXCR1 abgeleiteten Peptids auf seine Affinität untersucht. Durch Austausch von helixbildenden Peptidbausteinen mit helixbrechenden Peptoidbausteinen mit gleichen Seitenketten wurde deren Einfluss auf die Struktur des potentiell vororientierten IL8RPLoopsE Peptids untersucht und mit der Auswirkung analoger Austausche an einem unstrukturierten Peptid verglichen, das aus dem N-Terminus des gleichen Rezeptors abgeleitet wurde und damit den anderen Teil der Bindungsstelle nachahmt. Bei Varianten des von vornherein unstrukturierten Peptids führten die helixbrechenden Reste zu einer Abschwächung der Bindungsaffinität, während helixbrechende Reste des IL8RPLoops Peptids diese vollständig verloren. Im CD-Spektrum dieser Varianten waren keine alpha-helikalen Anteile erkennbar. Es wurden MD-Simulationen durchgeführt, um Voraussagen über die Vororientierung der IL8RPLoops Derivate zu treffen. Dabei zeigte sich, dass die Termini von IL8RPLoopsE im Vergleich zu IL8RPLoopsQ sehr nah beieinander liegen und über Wasserstoffbrücken miteinander wechselwirken, so dass ein nicht-kovalenter Zyklus in Lösung vorliegt. Um den Einfluss dieser zyklischen Konformation auf die Bindungseigenschaften der beiden Peptide zu untersuchen, wurden diese durch orthogonale side-chain-to-tail Makrozyklisierung modifiziert. Die kovalente Zyklisierung erhöhte die Affinität des bindenden, linearen Peptids nur leicht, während die vorher nicht-bindende Variante nach Zyklisierung nun fast die gleiche Affinität aufwies. Beide zyklisierten Peptide zeigten in Fluoreszenzanisotropie-Messungen eine hohe Anisotropie, die bei Bindung an CXCL8 sank. MD-Simulationen wiesen darauf hin, dass der Fluorophor, der an einem flexiblen Linker verknüpft war, mit dem Peptid-Makrozyklus interagierte und bei Bindung des Peptids an das Chemokin verdrängt wurde. Die daraus resultierende Beweglichkeit des Fluorophors führt zu niedriger Fluoreszenzanisotropie, ein Effekt der als „Propeller-Effekt“ bekannt ist. Die Makrozyklisierung der Peptide hatte außerdem im Vergleich zu den linearen Varianten eine Erhöhung der Stabilität gegenüber proteolytischem Abbau zur Folge. Im zweiten Teil der Arbeit sollten Peptidomimetika aus kombinatorischen Bibliotheken identifiziert und weiterentwickelt werden. Die Mix-and-Split Synthese ist eine Strategie, um schnell und einfach eine große und diverse Anzahl von Substanzen zu synthetisieren, die bindende und inhibierende Eigenschaften gegenüber einem Zielprotein aufweisen können. Das Screening einer solchen One-bead-one-compound (OBOC) Bibliothek ist nicht trivial und häufig mit kostspieligen Strategien und Gerätschaften verbunden. Es wurden daher in dieser Arbeit eine Methode, basierend auf zwei-Kanal-Fluoreszenzmikroskopie und eine Methode basierend auf modifizierten Magnetpartikeln validiert, die ein einfaches und kostengünstiges Screening dieser Substanzbibliotheken ermöglichen können. Zur Methodenentwicklung wurde eine Auswahl an Streptavidin bindenden Peptiden auf TentaGel-HMBA-Syntheseharzsynthetisiert und am Harz entschützt. Diese Peptide deckten ein weites Spektrum von Bindungsaffinitäten, als auch andere physikochemische Eigenschaften, wie Nettoladung und Länge der bindenden Sequenz, ab, um eine Aussage über die Anwendbarkeit und Mindestaffinität für die Detektion beider Verfahren treffen zu können. Im fluoreszenzbasierten Verfahren wurden diese Peptide mit fluoreszent-markiertem Streptavidin inkubiert und mit kurzer Belichtungszeit im RHO und FITC-Kanal des Fluoreszenzmikroskops fotografiert, um das Photobleaching zu minimieren. Sekundäre Wechselwirkungen durch elektrostatische Interaktion der mit Peptiden funktionalisierten Partikel und des fluoreszenzmarkierten Proteins wurden durch Variation des Farbstoffs und Kontrollpartikel ausgeschlossen. Die resultierende Methode ist dafür geeignet, kurze Sequenzen, die im niedrigen mikromolaren Bereich an das Zielprotein binden, zu identifizieren. Sie wurde in nachfolgenden Arbeiten dafür verwendet eine Bibliothek von linearen Peptoid-Hexameren erfolgreich gegen CXCL8 zu screenen und im Anschluss daran 17 Hits zu identifizieren und zu charakterisieren. Im Magnetpartikel-basierten Verfahren wurde die gleiche Auswahl von immobilisierten Peptiden mit Streptavidin-beschichteten Magnetpartikeln behandelt, wobei die Partikel der Biotin-Positivkontrolle und der am stärksten bindende Sequenz ausreichend mit Magnetpartikeln beladen werden konnten, um im Magnetfeld eines Handmagneten mobilisiert zu werden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Streptavidin-Magnetpartikel mit biotinyliertem CXCL8 beladen und anschließend zur Abtrennung von CXCR1 transfizierte HEK293-Zellen aus einer Suspension und neutrophilen Granulozyten aus Vollblut verwendet werden können. Schließlich wurde eine OBOC-Bibliothek aus 100 000 verschiedenen makrozyklisierten pentameren Peptoiden synthetisiert und mit Hilfe des magnetpartikelbasierten Verfahrens 22 CXCL8 bindende Partikel aus dieser isoliert. Die Sequenzierung und Charakterisierung dieser Liganden ist Bestandteil nachfolgender Arbeiten. Da die Makrozyklisierung in dieser Arbeit bereits bei CXCL8 bindenden Peptiden zu einer Erhöhung der konformationellen Rigidität und Bindungsaffinität geführt hatte, wurde diese Strategie auch auf die linearen Hexapaptoide aus dem Screening mit 2-Kanal Fluoreszenzmikroskopie angewandt. Es wurde eine on-bead Makrozyklisierung und Fluoreszenzmarkierung dieser 17 Peptoide über zwei zusätzlich am C-Terminus eingeführte orthogonal geschützte Lysinreste durchgeführt. Die resultierenden TAMRA-markierten makrozyklischen Peptomere zeigten ebenfalls den oben beschriebenen „Propeller-Effekt“, und es konnte eine Erhöhung der Bindungsaffinitäten zu CXCL8 um etwa eine Größenordnung im Vergleich zu den entsprechenden linearen Sequenzen nachgewiesen werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
As small signaling molecules of the immune system chemokines play an essential role in various chronic inflammatory and auto immune diseases. The inhibition of interactions of these molecules and their corresponding receptors is a key strategy in the development of new pharmaceuticals for the treatment of these inflammatory diseases. One approach to inhibit chemokines is the design of peptides derived from receptor sequences, which are able to mimic the native protein-receptor interaction to bind and inhibit the chemokine directly. In previous work using molecular modeling techniques a peptide was designed that mimics the binding sites of the CXCL8-binding receptor CXCR1. This peptide, called IL8RPLoops, contained sequences of two extracellular loops of the receptor, each sufficiently long to form helical turns. It binds to CXCL8 with micromolar affinity and we assumed that a preorientation of the peptide termini in solution into a receptor-like conformation responsible for the high binding affinity of this linear peptide. Further investigations showed that instead of the C-terminal glutamic acid a glutamine was incorporated into the peptide by deamidation and this substitution promoted the formation of secondary structures in the peptide. In the first part of this work the impact of the secondary structure of the receptor CXCR1-derived peptide on its binding affinity to CXCL8 was investigated. By substitution of helix-promoting residues in the peptide sequence with helix-breaking peptoid building blocks that share the same side chain the effect of a possible preorientation of peptide IL8RPLoopsE was examined. The results were compared to the effect of comparable substitutions in an unstructured CXCL8 binding peptide derived from the N-terminus of CXCR1 mimicking another part of the binding site. In peptide-peptoid-chimeras of this unstructured peptide helix-breaking substitutions lead to a decrease in binding affinity, while with substitutions in variants of IL8RPLoops, binding affinity diminished completely and no alpha-helical character was detected via CD spectroscopy. MD-simulations were performed to predict a preorientation of the IL8RPLoops derivatives with glutamic acid and glutamate. It could be shown that the termini of IL8RPLoopsE were located in close proximity to each other and formed a non-covalent macrocycle while IL8RPLoopsQ was more flexible in structure. To investigate the influence of the macrocyclic conformation on the respective binding properties of the peptides both were modified via side-chain-to-tail macrocyclization. While covalent cyclization enhanced affinity of the already binding peptide only slightly, the previously non-binding variant now bound with nearly the same affinity to CXCL8. Both macrocyclic peptides showed high fluorescence anisotropy, which decreases upon binding to CXCL8. MD-simulations showed evidence of the fluorophore interacting with the free peptide macrocycle, but being displaced upon binding with the Chemokine. The resulting increase in flexibility of the fluorophore leads to decreased fluorescence anisotropy, which is known as the “propeller effect”. Macrocyclization of the peptides also enhanced their stability against proteolysis compared to their respective linear counter parts. In the second part of this work peptidomimetics derived from combinatorial libraries should be identified and evolved further. The mix-and-split synthesis is a strategy to quickly and easily generate a large and diverse amount of different substances potentially showing binding and inhibitory properties against a target protein. Screening of one-bead-one-compound (OBOC) libraries is a challenging task often linked with costly methods and hardware. Thus, in this work screening methods based on two-channel fluorescence microscopy and magnetic particle separation were validated to provide an easy and cost-efficient way for screening of these compound libraries. For method development a selection of peptides able to bind to streptavidin were synthesized on TentaGel-HMBA synthesis resin and deprotected on bead. These peptides covered a wide range of binding affinities and other physicochemical properties like net charge and sequence length to examine the applicability of the screening strategies and the detection limits based on the represented affinity range. In the fluorescence-based strategy these peptides were incubated with fluorescently labeled streptavidin and photographed with short exposure times in RHO and FITC channel to minimize photo bleaching. The impact of secondary interactions due to coulombic forces between peptide and fluorescently-labeled protein was eliminated by variation of the fluorescence dye and control particles. The resulting method was found to be applicable for screening of short ligand sequences binding with affinities in the lower micromolar range. This strategy was successfully used in subsequent work in a screening for linear peptoid-hexamers able to bind to CXCL8, which resulted in the characterization of 17 hits derived from an OBOC library. In the strategy based on magnetic particle separation the same selection of immobilized peptides was used and incubated with streptavidin-coated magnetic particles, with resin functionalized with biotin serving as positive control being able to be mobilized in a magnetic field. It could be shown that magnetic beads functionalized with streptavidin and loaded with a CXCL8-biotin conjugate could be used to separate HEK293-cells transfected with receptor CXCR1 from a suspension and even isolate neutrophilic granulocytes from a sample of blood. Subsequently an OBOC library consisting of 100,000 different macrocyclizised peptoid-pentamers was synthesized and 22 hits with affinity for CXCL8 could be separated via magnetic screening. Sequencing and characterization of the hits derived from screening was part of following works. Since macrocyclization of CXCL8 binding peptides in this work led to increased conformational rigidity and binding affinity this strategy was also applied for a selection of peptoid-hexamers derived from a two-channel-fluorescence microscopy screening. An on-bead macrocyclization was conducted on 17 fluorescently labeled peptoids mediated via introduction of two orthogonally protected lysine side chains on the peptoid C-terminus. The resulting TAMRA-labeled macrocyclic peptomers also showed the “propeller effect” mentioned above and exhibited an improvement of binding affinities by one order of magnitude compared to their linear counter parts.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Biologische Chemie
Date Deposited: 10 Jun 2020 12:38
Last Modified: 10 Jun 2020 12:38
DOI: 10.25534/tuprints-00011794
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-117946
Referees: Schmitz, Prof. Dr. Katja and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Refereed: 20 April 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/11794
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