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Auswirkungen von Schwermetallionen auf Halobacterium salinarum R1: Vergleichende Analysen zellulärer und molekularer Stressreaktionen in planktonischen Zellen und Biofilmen

Völkel, Sabrina (2020):
Auswirkungen von Schwermetallionen auf Halobacterium salinarum R1: Vergleichende Analysen zellulärer und molekularer Stressreaktionen in planktonischen Zellen und Biofilmen.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00011494,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Auswirkungen von Schwermetallionen auf Halobacterium salinarum R1: Vergleichende Analysen zellulärer und molekularer Stressreaktionen in planktonischen Zellen und Biofilmen
Language: German
Abstract:

Halobacterium salinarum R1 ist ein extrem halophiles Archaeon, welches die Fähigkeit besitzt zu adhärieren und Biofilme zu bilden. In der Natur kommen Haloarchaea in besonders salzreichen Habitaten wie Salzseen oder Salinen vor, welche aufgrund von Industrialisierungsprozessen häufig mit Schwermetallen belastet sind. Die Auswirkungen von Schwermetallen auf betroffene Mikroorganismen, insbesondere auf Haloarchaea sind jedoch weitestgehend unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung von zellulären und molekularen Prozessen im Umgang mit den zwei bivalenten Metallionen Cu2+ und Ni2+ in H. salinarum R1 planktonischen Zellen und Biofilmen.

Um die Auswirkungen von Cu2+ und Ni2+ auf zellulärer Ebene zu untersuchen, erfolgten Analysen des planktonischen Wachstums sowie der Adhäsion und Biofilmbildung in H. salinarum R1. In Gegenwart von subinhibitorischen Metallionen-Konzentrationen ergaben Fluoreszenz-basierte Adhäsionstests eine bis zu 70% verringerte Adhäsion im Fall von Cu2+, während die Anwesenheit von Ni2+ die Zelladhäsion bis zu 30% erhöhte. Die Zugabe von Wachstums-inhibierenden Cu2+-/Ni2+-Konzentrationen auf reife Biofilme resultierte im Fall von Cu2+ in einer Ablösung von bis zu 70% der sessilen Zellen, wobei mittels mikroskopischer Analysen eine vermehrte Aggregatbildung beobachtet wurde. Gegenteilige Effekte zeigte die Zugabe von Ni2+, welche zu einer etwa 70% erhöhten Anzahl von Zellen im Biofilm und einer Verdichtung der Biofilmarchitektur führte. PMA-qPCR-basierte Untersuchungen der Zellvitalität nach Cu2+-/Ni2+-Behandlung ergaben eine bis zu 80% erhöhte Resistenz in Biofilmen im Vergleich zu planktonischen Zellen. Quantitative Analysen der isolierten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) von unbehandelten sowie von Cu2+-/Ni2+-behandelten Biofilmen zeigten eine signifikante Erhöhung des EPS-Anteils nach Metallionenbehandlung sowie Cu2+-/Ni2+-spezifische Änderungen des Proteingehalts als Hauptbestandteil der EPS-Matrix in H. salinarum. Darüber hinaus ergaben spektrometrische Analysen der Cu2+-/Ni2+-Konzentrationen, dass Biofilmzellen im Vergleich zu planktonischen Zellen bis zu 32-fach verringerten Konzentrationen ausgesetzt sind. Da der größte Anteil der Metalle im Biofilm mit 65% Cu2+ bzw. 83% Ni2+ in den isolierten EPS quantifiziert wurde, scheint die EPS-Matrix eine wichtige Funktion in der Biofilm-vermittelten Resistenz einzunehmen.

Zur Untersuchungen der Auswirkungen der Metallionen auf molekularer Ebene erfolgte eine quantitative Proteomanalyse von Cu2+-/Ni2+-behandelten planktonischen Zellen und Biofilmen mittels SWATH-LC/MS/MS. Diese ergab mit 1.180 quantifizierten Proteinen eine Proteomabdeckung von 46%, wobei 269 Proteine (23%) signifikant veränderte Abundanzen nach Metallionenbehandlung zeigten. Diese sind mit 19,8% größtenteils auf planktonische Zellen zurückzuführen, während in Biofilmzellen lediglich 4,4% der quantifizierten Proteine signifikante Änderungen in Folge von Cu2+-/Ni2+-Stress aufwiesen. Vergleichende Analysen auf Transkriptebene mittels qRT-PCR bestätigten die unterschiedliche Auswirkung der Metallionen auf die zwei Lebensformen. Untersuchungen der Proteinverteilung zeigten, dass planktonische Zellen mit 47% gemeinsam auftretenden Proteinen mit einer ähnlichen Stressreaktion auf Cu2+ und Ni2+ reagierten, wobei hauptsächlich transkriptionsregulierende und ribosomale Proteine in erhöhten relativen Häufigkeiten auftraten. Dagegen zeigten viele ABC-Transportsysteme eine signifikante Verringerung in Anwesenheit von Cu2+ bzw. Ni2+. In Biofilmen traten nur 3% der Proteine gemeinsam in Cu2+- und Ni2+-behandelten Zellen auf, was auf Metall-spezifische Reaktionen schließen lässt und auf die Relevanz der Cu2+-/Ni2+-spezifischen Proteine in Bezug auf die starken Auswirkungen auf die Biofilmarchitektur hindeutet.

Zur Aufklärung der Funktion von Proteinen mit signifikant veränderten relativen Häufigkeiten nach Cu2+-/Ni2+-Stress erfolgten Deletionen von insgesamt 13 Genen. Die entsprechenden Deletionsmutanten wurden auf ihre Reaktion mit Cu2+ bzw. Ni2+ hin untersucht, und zwar durch Analysen des Wachstums, der Adhäsion und Biofilmbildung sowie im Hinblick auf eine Proteaseaktivität. Alle wiesen mindestens eine Metall-bedingte Änderung im Vergleich zum H. salinarum Wildtyp auf. Besonders starke Effekte zeigte die Deletion der Cu2+-exportierenden ATPase CopA, welche in Anwesenheit von Cu2+ in einer Inhibition des Wachstums und der Adhäsion der Zellen resultierte und demnach eine wichtige Funktion in der Cu2+-Homöostase einzunehmen scheint. In Gegenwart von Ni2+ wurden bei der Gendeletion eines ABC-Transporter-Proteins bzw. eines uncharakterisierten Proteins starke Auswirkungen auf die Biofilmarchitektur beobachtet, was auf eine wichtige Rolle dieser Proteine in der Ni2+-spezifischen Stressreaktion hindeutet.

Die Ergebnisse dieser Arbeit geben einen umfassenden Einblick in die zellulären und molekularen Reaktionen von planktonischen Zellen und Biofilmen des Haloarchaeons H. salinarum R1 im Umgang mit Schwermetallionen und können als Basis für weitere Analysen der zugrundeliegenden Resistenzmechanismen bzw. Stressreaktionen von Mikroorganismen in Schwermetall-belasteten Habitaten dienen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Halobacterium salinarum R1 is an extremely halophilic archaeon, which is able to adhere to surfaces and form biofilms. In nature, Haloarchaea are found in high salt habitats such as salt lakes or salt crystallizer ponds, which are often contaminated by heavy metals due to industrialization processes. However, the effects of heavy metals on microorganisms, especially on Haloarchaea, are largely unknown. The aim of the present work was the elucidation of cellular and molecular processes in response to the bivalent metal ions Cu2+ and Ni2+ in H. salinarum R1 planktonic cells and biofilms. To investigate the effects of Cu2+ and Ni2+ on the cellular level, analyses of planktonic growth as well as adhesion and biofilm formation in H. salinarum R1 were performed. In the presence of subinhibitory metal ion concentrations, fluorescence-based adhesion tests revealed up to 70% reduced adhesion in case of Cu2+, while the presence of Ni2+ increased cell adhesion up to 30%. The addition of growth-inhibiting Cu2+-/Ni2+ concentrations to mature biofilms resulted in a detachment of up to 70% of sessile cells in case of Cu2+, whereas increased formation of cell aggregates was observed by microscopic analyses. The addition of Ni2+ showed contrary effects, leading to an increased number of cells in the biofilm by about 70% and a more compact biofilm architecture. PMA-qPCR-based investigations of cell vitality after Cu2+-/Ni2+ treatment showed up to 80% increased resistance in biofilms compared to planktonic cells. Quantitative analyses of isolated extracellular polymeric substances (EPS) of untreated as well as Cu2+-/Ni2+ treated biofilms showed a significant increase in EPS content after metal ion treatment as well as Cu2+-/Ni2+-specific changes in protein content as main component of the EPS matrix in H. salinarum. Furthermore, spectrometric analyses of Cu2+-/Ni2+ concentrations showed that biofilm cells are exposed to up to 32-fold lower concentrations compared to planktonic cells. Since the largest proportion of metals in the biofilm was quantified with 65% Cu2+ and 83% Ni2+ in the isolated EPS, the EPS matrix seems to play an important role in the biofilm-mediated resistance. To investigate the effects of metal ions at the molecular level, a quantitative proteome analyses of Cu2+-/Ni2+ treated planktonic cells and biofilms was performed using SWATH-LC/MS/MS. With 1,180 quantified proteins, the proteome coverage was 46%, with 269 proteins (23%) showing significantly changed abundances after metal ion treatment. The majority (19.8%) of these changes were caused by planktonic cells, while in biofilm cells only 4.4% of the quantified proteins showed significant changes following Cu2+-/Ni2+ stress. Comparative analyses at the transcript level using qRT-PCR confirmed the contrary effect of the metal ions on planktonic and sessile cells. Investigations of protein distribution showed that planktonic cells had a similar stress response to Cu2+ and Ni2+ with 47% co-occurring proteins. These mainly include transcriptional regulation systems and ribosomal proteins both having increased relative abundances, whereas many ABC transport systems showed a significant reduction in the presence of Cu2+ and Ni2+. In biofilms, only 3% of the proteins occurred in both, Cu2+- and Ni2+ treated cells, suggesting metal-specific reactions and indicating the relevance of the Cu2+-/Ni2+-specific proteins in relation to the strong effects on biofilm architecture. To elucidate the function of proteins with significantly altered relative abundances after Cu2+-/Ni2+ stress, deletions of a total of 13 genes were performed. The corresponding deletion mutants were investigated with respect to Cu2+ or Ni2+ treatment by analyses of growth, adhesion and biofilm formation as well as with regard to protease activity. All of them showed at least one metal-related change compared to H. salinarum wild type. Particularly strong effects were shown by the deletion of the Cu2+-exporting ATPase CopA, which resulted in an inhibition of cell growth and adhesion in the presence of Cu2+ and thus seems to play an important role in Cu2+ homeostasis. In the presence of Ni2+, strong effects on the biofilm architecture were observed in the mutant strain lacking the gene coding for an ABC- transporter protein and an uncharacterized protein, respectively, indicating an important role of these proteins in the Ni2+-specific stress response. The results of this work provide a comprehensive insight into the cellular and molecular reactions of planktonic cells and biofilms of the Haloarchaeon H. salinarum R1 coping with heavy metal ions. Additionally, these results provide a basis for further analyses of the underlying resistance mechanisms or stress reactions of microorganisms in heavy metal contaminated habitats.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Microbiology and Archaea
Date Deposited: 29 Jul 2020 08:49
Last Modified: 29 Jul 2020 13:03
DOI: 10.25534/tuprints-00011494
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-114944
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Kletzin, PD Dr. Arnulf
Refereed: 22 June 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/11494
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