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Arming Antibodies for Cancer Therapy: Transglutaminase-Mediated Toxin Conjugation

Deweid, Ludwig Lukas (2020):
Arming Antibodies for Cancer Therapy: Transglutaminase-Mediated Toxin Conjugation.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00011441,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation Luwig Lukas Deweid.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Arming Antibodies for Cancer Therapy: Transglutaminase-Mediated Toxin Conjugation
Language: English
Abstract:

The growing number of malignant cancer cases worldwide is an enormous threat for modern society. Therefore, the efforts of scientists from various research fields are focused on the development of efficient and viable therapeutic approaches. Recently, site-specific conjugation of highly potent organic compounds to tumour-binding immunoglobulins towards antibody-drug conjugates (ADCs) emerged as a promising strategy for the treatment of cancer. To allow for the precise modification of antibodies, multiple chemical and enzymatic methodologies have been developed within the last decades. Among them, application of microbial transglutaminase (mTG) from Streptomyces mobaraensis represents a promising approach. This enzyme that natively catalyses formation of isopeptide bonds between glutamine and lysine side chains, has been recently used for the assembly of ADCs. Although native residues within human antibodies cannot be employed in mTG catalysis, incorporation of reactive peptidyl linker sequences or truncation of the CH2 glycan to expose Gln295 were shown to overcome this limitation. In the present work, we focused on improving the performance of mTG catalysis towards efficient and rapid generation of ADCs by engineering both the enzyme and the targeted immunoglobulin. To that end, three independent studies were conducted: (1) Microbial transglutaminase is a useful tool for the crosslinking of diverse molecules due to its ability to form stable isopeptide bonds between proteinaceous glutamine residues and primary amines. However, tailoring of transglutaminase is desired because the substrate indiscrimination of mTG can lead to heterogeneous product formation. In this part of my thesis, we aimed at the development of a molecular platform for the engineering of transglutaminase towards altered activity and selectivity by yeast surface display (YSD) in combination with fluorescence-activated cell sorting (FACS). Due to its intracellular cytotoxicity, mTG was displayed on the surface of Saccharomyces cerevisiae cells as an inactive zymogen. The precursor was converted into the mature enzyme by the addition of different proteases and a biotinylated glutamine-donor peptide LLQG was added. The surface-anchored enzyme catalyses the respective transamidation of the supplemented substrate at available lysine residues, thus enabling the identification of active variants. We demonstrated that genotype-phenotype correlation is provided and constructed a randomised library comprising 3×108 different mutants. After five rounds of FACS-screening against biotin-GSGLLQG, 150 individual clones were analysed on the surface of yeast cells and compared to the wildtype enzyme. Upon recombinant expression, six mutants revealed improved consumption of the corresponding peptide in an HPLC-controlled assay and a triple mutant R5.2 (S2G/R15C/M234L) labelled LLQG-tagged therapeutic antibody trastuzumab more efficiently compared to the wildtype counterpart. Site-specific conjugation mediated by mutant transglutaminases with elevated catalytic performance might improve coupling efficiency and increase yields upon the construction of antibody-drug conjugates. (2) In addition to enzyme optimization, improvement of catalytic efficiency can be achieved upon engineering of the genetically incorporated mTG recognition sequence. The reactivity of the enzyme is influenced by charge and polarity of the amino acids surrounding the addressed glutamine as well as by the spatial arrangement of the targeted protein. In previous work, Siegmund et al. demonstrated that mimicking glutamine-donor sites of natural mTG substrates is a fruitful approach to yield peptidyl-linker sequences, which mediate proper modification by the enzyme. We aimed at the identification of novel recognition sequences derived from intrinsic mTG substrates dispase-autolysis inducing protein (DAIP) and Streptomyces papain inhibitor (SPIP) towards efficient modification of therapeutic antibodies. To that end, sequences derived from Gln6 of SPIP as well as Gln39 and Gln298 of DAIP were synthesized as oligopeptides by microwave-assisted Fmoc solid-phase peptide synthesis (SPPS) and their reactivity in mTG-mediated conjugation of different linker substrates was determined. Upon C-terminal fusion of the respective sequences to the heavy chain of HER2-targeting antibody trastuzumab, mTG-promoted modification of the resulting constructs with model substrate N-(biotinyl)cadaverine (MBC) was investigated. Having demonstrated high reactivity in preliminary experiments, SPIP-derived sequence DIPIGQGMTG (SPI7G) was chosen for the assembly of an ADC in a twostep chemo-enzymatic approach. Engineered antibodies were labelled with N-[(1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyloxycarbonyl]-1,8-diamino-3,6-dioxaoctane (NH2-PEG2-BCN) by mTG within a drastically shortened reaction time. Subsequently, BCN-modified monoclonal antibodies (mAb) were armed with the cytotoxic agent monomethyl auristatin E (MMAE) for selective growth inhibition of HER2-overexpressing breast cancer cells by strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC). Due to the superior labelling efficiency, an ADC assembled from the newly identified sequence SPI7G was significantly more potent on HER2-positive SKBR3-cells compared to a conventional LLQG-motif. We were able to show that intrinsic mTG substrates can be rapidly harnessed as a source of potent bioconjugation tags. Within a short reaction time of 1 h, a novel sequence SPI7G outperformed the conventional tag LLQG when located at the C-terminus of the heavy chain of trastuzumab. Such a short reaction time minimizes the risk of yield-limiting protein denaturation that often occurs during commonly applied overnight reactions. (3) Incorporation of specific mTG recognition tags into the framework of antibodies proved to be a powerful approach for their labelling. However, longer sequences may interfere with the antibody’s intrinsic stability and trigger the patient’s immune response during treatment. We investigated different positions of a human IgG Fc (fragment crystallisable) to identify sites that allow for mTG-mediated labelling upon single residue substitution to reduce undesired immunogenicity and instability risks. In a first step, a straightforward strategy for the recombinant expression of the Fc in E. coli cells was established. The fragment was purified by Ni2+-affinity chromatography in sufficient yields and analysed by non-reducing SDS-PAGE, thermal shift assays and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) regarding dimeric assembly and native disulfide formation. Site-directed mutagenesis was used to specifically introduce glutamine substitutions within the Fc and the mutants were screened for labelling by mTG in a rapid fluorescent assay. Out of 30 analysed positions, two mutations, namely I253Q and Y296Q were efficiently labelled with a fluorescent amine substrate by mTG. These promising results need to be further confirmed in the context of a full-length antibody to study their usefulness for the mTG-mediated construction of ADCs.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die Anzahl an Krebsdiagnosen weltweit steigt stetig und Wissenschaftler verschiedener Disziplinen sind dadurch gefordert, innovative, effiziente und patientenfreundliche Therapien zu entwickeln. Unter anderem erwiesen sich Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) als eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Krebs, welche durch die Konjugation von potenten, organischen Molekülen an tumour-spezifische Immunglobuline generiert werden. In den letzten Jahrzehnten wurde eine Vielzahl chemischer und enzymatischer Methoden entwickelt, um die präzise Modifikation von Antikörpern zu ermöglichen. Das Enzym mikrobielle Transglutaminase (mTG) aus Streptomyces mobaraensis, welches natürlicherweise Isopeptidbindungen zwischen Glutamin- und Lysinseitenketten bildet, wurde unlängst für die Erzeugung von ADCs verwendet. Leider können natürlich vorkommende Aminosäuren humaner Antikörpern jedoch nicht mittels mTG-adressiert werden. Diese Einschränkung kann umgangen werden indem entweder peptidische Erkennungssequenzen auf genetischer Ebene in die natürliche Sequenz des Antikörpers eingefügt werden oder die Zuckerseitenkette der CH2-Domäne entfernt wird, wodurch Gln295 als Markierungsstelle verfügbar wird. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung der mTG-vermittelten Katalyse für die effiziente und schnelle Erzeugung von ADCs, wobei sowohl das eingesetzte Enzym als, auch der adressierte Antikörper modifiziert werden. Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Studien durchgeführt: (1) Mikrobielle Transglutaminase ist ein nützliches Werkzeug für die Vernetzung unterschiedlichster Zielmoleküle, da es stabile Isopeptidbindungen zwischen Glutaminresten und primären Aminen bilden kann. Ein Zugang zu maßgeschneiderten Transglutaminasen wäre jedoch wünschenswert, da die bis heute nicht vollständig verstandene Substratspezifität des Enzymes zu heterogener Produktbildung führen kann. Dieser Teil der vorliegenden Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung eines Verfahrens zur Optimierung von mTG mittels Hefeoberflächendisplay (YSD) und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), um Varianten mit erhöhter Aktivität und veränderter Substratspezifität aus einem großen Spektrum zufallsmäßig generierter Mutanten, zu identifizieren. Aufgrund seiner intrazellulären Toxizität wurde mTG als inaktives Zymogen auf der Oberfläche von Saccharomyces cerevisiae Zellen präsentiert, welches anschließend durch Zugabe unterschiedlicher Proteasen in das reife Enzym umgewandelt wurde. Nach Zugabe des biotinylierten Glutamin-Donor-Peptids LLQG, katalysiert das oberflächenverankerte Enzym die Transamidierung des supplementierten Substrats an räumlich verfügbaren Lysinresten und ermöglicht so die Identifizierung aktiver Varianten aus einer Mischung mit inaktiven Varianten. Anschließend wurde eine randomisierte Bibliothek mit 3×108 verschiedenen Mutanten erzeugt. Nach fünf Runden FACS-Durchmusterung gegen das Substrat Biotin-GSGLLQG wurden 150 einzelne Klone auf der Oberfläche von Hefezellen analysiert und mit dem Wildtyp-Enzym verglichen. Nach rekombinanter Expression zeigten sechs Mutanten einen verbesserten Umsatz des entsprechenden Peptids in einem HPLC-basierten Assay. Des Weiteren, markierte die dreifach Mutante R5.2 (S2G/R15C/M234L) den therapeutischen Antikörper Trastuzumab, welcher eine LLQG Erkennungssequenz trug, effizienter als die Wildtyp-Referenz. Durch optimierte Transglutaminasen mit erhöhter katalytischer Leistung könnten die Kopplungseffizienz und die Ausbeuten bei der ortsspezifischen Konstruktion von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten verbessert und dadurch deren Produktionskosten gesenkt werden. (2) Neben der Optimierung des verwendeten Enzyms kann ebenfalls die genetisch inkorporierte mTG-Erkennungssequenz verbessert werden, um eine effizientere Katalyse zu erreichen. Die Reaktivität des Enzyms wird durch die Ladung und die Polarität der Aminosäuren, die das adressierte Glutamin umgeben, sowie der räumlichen Anordnung dieser Sequenz innerhalb des Zielproteins, beeinflusst. In früheren Arbeiten konnten Siegmund und Kollegen zeigen, dass natürliche Glutamin-Donor-Stellen intrinsischer mTG-Substrate nachgeahmt werden können um die Modifikation von therapeutischen Antikörpern mittels mTG zu ermöglichen. In diesem Teil der vorliegenden kumulativen Arbeit sollen Erkennungssequenzen, die die effiziente Markierung von Antikörpern ermöglichen, von den intrinsischen mTG-Substraten Dispase-Autolyse-induzierendes Protein (DAIP) und Streptomyces-Papain-Inhibitor (SPIP) abgeleitet werden. Zu diesem Zweck wurden Sequenzen, die vom Gln6 des SPIP, sowie von Gln39 und Gln298 des DAIP abstammen, mittels mikrowellenunterstützter Fmoc-Festphasenpeptidsynthese (SPPS) als Oligopeptide synthetisiert, und ihre Umsetzung durch mTG mit verschiedenen Linkersubstraten bestimmt. Nach der C-terminalen Fusion der jeweiligen Sequenzen an die schwere Kette des HER2-targetierenden Antikörpers Trastuzumab, wurde die mTG-vermittelte Modifikation der resultierenden Konstrukte mit dem Modellsubstrat N-(Biotinyl) Cadaverin (MBC) untersucht. Die von SPIP abgeleitete Sequenz DIPIGQGMTG (SPI7G) zeigte in vorhergegangenen Experimenten eine hohe Reaktivität und wurde aufgrund dessen für die Erzeugung eines ADC durch chemo-enzymatische zweischritt-Synthese, ausgewählt. Die C-terminal modifizierten Antikörper wurden in einer zeitlich stark begrenzen Reaktion mittels mTG mit N-[(1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-in-9-ylmethyloxycarbonyl]-1,8-diamino-3,6-dioxaoctan (NH2-PEG2-BCN) modifiziert. Anschließend wurden die BCN-modifizierten Antikörper mittels SPAAC (strain-promoted alkine-azide cycloaddition) mit dem zytotoxischen Wirkstoff Monomethylauristatin E (MMAE) ausgerüstet, um das Wachstum HER2-überexprimierender Brustkrebszellen selektiv zu hemmen. Aufgrund der verbesserten Markierungseffizienz, war ein ADC der ausgehend von der neu identifizierten Sequenz SPI7G zusammengesetzter wurde, wesentlich wirksamer gegen HER2-positive SKBR3-Zellen als eine Referenz mit dem herkömmlichen LLQG-Motiv. Es konnte gezeigt werden, dass intrinsische mTG-Substrate einfach als Quelle für potente Erkennungssequenzen genutzt werden können. Innerhalb einer stark eingeschränkten Reaktionszeit von 1 h, wurde die neue Sequenz SPI7G am C-Terminus der schweren Kette von Trastuzumab, fünffach effizienter mit dem Molekül NH2-PEG2-BCN modifiziert als der LLQG-markierte Referenzantikörper. Für die mTG-vermittelte Erzeugung von ADCs werden typischerweise Reaktionszeiten von >16 h angewandt wobei es zu unerwünschten Schädigungen durch lange thermische Belastung, und somit Verringerung der Ausbeute kommen kann. Eine verkürzte Reaktionszeit, die durch effizientere Erkennungssequenzen ermöglicht wird, könnte diese Gefahr minimieren und somit den gesamten Prozess der mTG-vermittelten ADC Generierung verbessern. (3) Der Einbau von spezifischen mTG-Erkennungssequenzen in das Grundgerüst von Antikörpern ist eine bewährte Methode für deren Markierung mit unterschiedlichen Zielmolekülen. Längere Sequenzen können jedoch die intrinsische Stabilität des Antikörpers beeinträchtigen und eine Immunantwort des Patienten während der Behandlung auslösen. In diesem Teil der vorliegenden kumulativen Arbeit wurden verschiedene Positionen eines humanen IgG Fc (fragment crystallisable) untersucht um Positionen zu identifizieren, die nach Austausch gegen Glutamin eine Markierung mittels mTG ermöglichen. Durch den Austausch einer einzelnen Aminosäure soll das potenzielle Risiko von Immunogenität und Instabilität im Vergleich zu langen Erkennungssequenzen, verringert werden. Zuerst wurde eine einfache Strategie für die rekombinante Expression des Antikörper Fc in E. coli-Zellen etabliert. Das Fragment wurde in ausreichenden Mengen durch Ni2+-Affinitätschromatographie gereinigt und mittels nichtreduzierender SDS-PAGE, Thermal Shift Assays und Flüssigchromatographie-gekoppelter Massenspektrometrie hinsichtlich seiner strukturellen Integrität untersucht. Mithilfe von ortsgerichteter Mutagenese wurden Glutamin-Austausche innerhalb des Fc eingeführt und deren Markierung durch mTG in einem Fluoreszenz-basierten Assay untersucht. Von den 30 untersuchten Positionen wurden zwei Varianten (I253Q und Y296Q) mit einem fluoreszierenden Amin-Substrat durch mTG markiert. Diese vielversprechenden Ergebnisse müssen im Kontext eines vollständigen Antikörpers bestätigt werden, um ihren Nutzen für die mTG-vermittelte Konstruktion von ADCs zu belegen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 21 Feb 2020 14:23
Last Modified: 21 Feb 2020 14:24
DOI: 10.25534/tuprints-00011441
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-114410
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Süß, Prof. Dr. Beatrix
Refereed: 3 February 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/11441
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