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Studien zur physiologischen Relevanz der hAQP1 vermittelten CO2 Membrandiffusion

Elsholz, Paul (2020):
Studien zur physiologischen Relevanz der hAQP1 vermittelten CO2 Membrandiffusion.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00011309,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Studien zur physiologischen Relevanz der hAQP1 vermittelten CO2 Membrandiffusion
Language: German
Abstract:

Das humane Aquaporin 1 ist ein membranständiges Protein, welches als Homotetramer vorliegt und so einen Komplex mit mehreren Poren in der Membran bildet. Eine Funktion dieses Komplexes ist die Erleichterung des passiven Transports von Wasser über die Membran. Eine alternative Funktion, der CO2 Transport, wird schon seit den 1990er Jahren diskutiert und ist v.a. auf Grund des fehlenden Nachweises physiologischer Relevanz umstritten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der CO2 Transport über hAQP1 in künstlichen Systemen und nach Expression im pflanzlichen Organismus untersucht.

Bei sättigender Lichtintensität wird die Photosynthese durch die Verfügbarkeit von CO2 im Chloroplastenstroma limitiert. Die heterologe Expression von hAQP1 in Tabak war ausreichend, um diese Limitierung zu verschieben. Die Pflanzen zeigten eine 30 %ige Steigerung der Photosyntheserate, welche mit der verbesserten Diffusion von CO2 im Pflanzengewebe erklärt werden konnte.

Diese verbesserte Diffusion von CO2 im Pflanzengewebe wurde durch Analyse der CO2 Aufnahme auf zellulärer Ebene bestätigt. Das Expressionsniveau von hAQP1 der transgenen Pflanzen wurde mit q RT PCR und immunchemischem Nachweis ermittelt. hAQP1 konnte in der Plasmamembran sowie in den Chloroplasten transgener Pflanzen nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Verbesserung der Wasserpermeabilität sowie die Erhöhung der CO2 Aufnahmerate der untersuchten Zellen positiv mit dem Expressionsniveau von hAQP1 korrelieren.

Um die beobachteten Effekte der heterologen hAQP1 Expression in Tabak auf eine Funktionseigenschaft des Proteins zurückzuführen, wurde hAQP1 hinsichtlich des vermittelten CO2 Transports in einem streng kontrollierten System mit dem Aquaporin NtAQP1, welches über eine bekannte CO2-Transportfunktion verfügt, und dem Aquaporin NtPIP2;1, welches den Wassertransport erleichtert, verglichen. Hierfür wurden alle drei Proteine in einem synthetischen, zellfreien System exprimiert und in eine Kunstmembran, welche keine messbare CO2 Permeabilität besitzt, eingebaut. Bei der Untersuchung des CO2 Flusses über die so hergestellten Membranen konnte gezeigt werden, dass hAQP1 und NtAQP1 in diesem isolierten System in gleichem Maße die Membrandiffusion von CO2 ermöglichen, während der Einbau eines reinen Wassertransporters wie NtPIP2;1 zu keiner messbaren CO2 Diffusion über die Kunstmembran führt.

Die Auswirkungen des hAQP1 vermittelten CO2 Transports konnten somit von der molekularen, über die zelluläre und schließlich bis hin zur physiologischen Ebene in Tabak demonstriert werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The human aquaporin 1 is a membrane bound protein which is present as a homotetramer and thus forms a complex with several pores in the membrane. One function of this complex is to facilitate the passive transport of water across the membrane. An alternative function, the transport of CO2, has been discussed since the 1990s and is controversial due to the lack of evidence of physiological relevance. In the context of the present work, CO2 transport via hAQP1 in artificial systems and after expression in the plant organism was investigated. At saturating light intensity, photosynthesis is limited by the availability of CO2 in the chloroplast stroma. The heterologous expression of hAQP1 in tobacco was sufficient to shift this limitation. The plants showed a 30 % increase in photosynthesis rate, which could be explained by the improved diffusion of CO2 in plant tissue. This improved diffusion of CO2 in plant tissue was confirmed by analysis of CO2 uptake at the cellular level. The expression level of hAQP1 in transgenic plants was determined by q RT PCR and immunochemical detection. hAQP1 could be detected in the plasma membrane as well as in the chloroplasts of transgenic plants. Furthermore, it could be shown that the improvement of water permeability and the increase of CO2 uptake rate of the investigated cells correlate positively with the expression level of hAQP1. In order to attribute the observed effects of heterologous hAQP1 expression in tobacco to a functional property of the protein, hAQP1 was compared with aquaporin NtAQP1, which has a known CO2 transport function, and aquaporin NtPIP2;1, which facilitates water transport, with regard to mediated CO2 transport in a strictly controlled system. For this purpose, all three proteins were expressed in a synthetic, cell free system and incorporated into an artificial membrane that has no measurable CO2 permeability. When investigating the CO2 flow across the membranes produced in this way, it was shown that hAQP1 and NtAQP1 in this isolated system allow membrane diffusion of CO2 to the same extent, the insertion of a pure water transporter such as NtPIP2;1 does not lead to any measurable CO2 diffusion across the artificial membrane. The effects of hAQP1 mediated CO2 transport could thus be demonstrated from the molecular, cellular and finally up to the physiological level in tobacco.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Applied Plant Sciences
Date Deposited: 16 Jan 2020 07:23
Last Modified: 09 Jul 2020 06:23
DOI: 10.25534/tuprints-00011309
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-113097
Referees: Kaldenhoff, Prof. Dr. Ralf and Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich
Refereed: 19 December 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/11309
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